,懸浮,30min后使用。
[0052] 2. 2. 6 轉(zhuǎn)化 1) 取10y1的連接產(chǎn)物加入到裝有100y1感受態(tài)細(xì)胞的離心管中,輕輕轉(zhuǎn)動以混勻內(nèi) 容物,冰浴30min; 2) 將離心管放入42°C的水浴鍋中熱激90秒,快速轉(zhuǎn)至冰浴中10min; 3) 加入500y1LB液體培養(yǎng)基,于37°C,170rpm震蕩培養(yǎng)lh; 4) 取100mL涂布于含有氨芐青霉素的麥康凱固體培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公 司)上,于室溫下至涂布的菌液被培養(yǎng)基吸干,倒置培養(yǎng)皿,于37°C培養(yǎng)18~24h; 5) 挑取白斑。
[0053] 2. 2. 7重組克隆的PCR鑒定 挑取PCR陽性菌落分別接種于含100yg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中,37°C下劇烈震蕩 培養(yǎng)過夜,利用引物PI、P2對重組克隆進(jìn)行菌液PCR檢測。
[0054]PCR反應(yīng)體系 10yL:
2. 2. 8克隆后目的片段的測序 克隆得到的特異片段經(jīng)電泳檢測確定為目的片段后,上海生物工程有限公司完成測 序。
[0055] 2. 2. 9 SCAR標(biāo)記引物的設(shè)計 根據(jù)測序結(jié)果的兩端序列結(jié)合BS-5引物序列,在遵循引物設(shè)計原則的前提下,利用Primer5軟件設(shè)計引物。退火溫度(Tm)約為60°C,以確保其可靠性。引物設(shè)計的主要原 則為: 1)引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。
[0056] 2)引物長度一般在15~25堿基之間。
[0057] 3 )G+C含量在40%~60%之間。
[0058] 4)引物自身最好不要有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。
[0059] 5)引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。
[0060] 2. 2. 10 SCAR標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)
總體積 25 y L 3) PCR的擴(kuò)增程序:
2. 2. 11擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測 取5 y L的PCR產(chǎn)物和5 y L Trans 2K Plus DNA Marker分別與2 y L的6 X上樣緩沖 液(25 y L/L花青素)混合均勻后上樣,在1 X TAE緩沖液體系中,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠,120V電 泳lh;然后將膠放入IQuant capture凝膠成像分析系統(tǒng)中,進(jìn)行分析并拍照,觀察PCR產(chǎn) 物條帶。
[0061] 2. 2. 12特異片段的回收 方法同上。
[0062] 2. 2. 13 PCR產(chǎn)物的連接 方法同上。
[0063] 2. 2. 14大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 方法同上。
[0064] 2. 2. 15轉(zhuǎn)化 方法同上。
[0065] 2. 2. 16重組克隆的PCR鑒定 方法同上。
[0066] 2. 2. 17克隆后目的片段的測序 克隆得到的片段經(jīng)電泳檢測確定為目的片段后,菌液送上海生物工程有限公司完成測 序。
[0067] 2. 2. 18序列同源性分析 用統(tǒng)計軟件DNAMAN分析,得到各樣品的序列比對圖和同源關(guān)系樹狀圖3結(jié)果與分析 3. 1 BS-5引物的RAH)擴(kuò)增結(jié)果 引物BS-5的瓊脂糖電泳檢測的結(jié)果如圖(圖1)所示:圖片中2~23泳道的為蘭屬樣 品,24-31泳道為非蘭屬樣品,可以看出在非蘭屬的樣品不具有約為1070bp的特異性條 帶。 3. 2克隆后特異片段的測序 依圖4的擴(kuò)增條帶,選擇101號樣品llOObp左右的片段回收、克隆、測序。最終樣品101測序結(jié)果如下:
3. 3SCAR標(biāo)記引物的設(shè)計 用于SCAR標(biāo)記的引物序列為: SF:TGCGCCCTTCCATCACCTT SW:TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA 3. 4SCAR標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果 SCAR標(biāo)記得引物PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖(圖2)所示,2~5泳道,7~12泳道,18~23泳 道均為蘭屬樣本,5,13~17, 24~25泳道均為非蘭屬樣本,可以看出在非蘭屬的樣品不具 有約為1070bp的特異性條帶。 3. 5PCR產(chǎn)物克隆后質(zhì)粒檢測結(jié)果 PCR產(chǎn)物克隆后質(zhì)粒檢測結(jié)果如圖(圖3),1,4,9,13,16泳道均為藍(lán)斑質(zhì)粒,2,3,6~8, 11,12,14,15泳道均為白斑質(zhì)粒,5,10泳道為空。
[0068] SCAR標(biāo)記序列同源性分析 如圖4可以得出:所選的樣品序列同源率是在42%~98%之間,其中兔耳蘭(樣品40) 和墨蘭(101)最高,達(dá)98%,莎草蘭(200)和大雪蘭(7)為95%,但與其他樣品的同源率只有 42%。除莎草蘭(200)和大雪蘭(7)以外,所有的樣品的同源率為92%~98%。沒有任何兩 個樣品的序列是相同的,但因部分樣品間的序列差異較少,導(dǎo)致未能將所有樣品區(qū)分開來。 [0069] 標(biāo)記序列系統(tǒng)進(jìn)化分析 系統(tǒng)進(jìn)化樹狀圖(圖5 )可以看出:從整個群體上看,蘭屬植物在其染色體上SCAR標(biāo)記 處,堿基變異程度較大,明顯地分為兩個分支,其中一支(As支)由莎草蘭(200)和大雪蘭 (7)組成;另一支(Bs支)由其他樣品組成。Bs支又以微弱的區(qū)別分為兩支。
[0070]SCAR標(biāo)記的引物PCR擴(kuò)增結(jié)果可得到蘭屬樣本中能夠清晰地擴(kuò)增出約為1070bp 的特異性條帶,不同樣本基因序列見圖6。
[0071] 實(shí)施例2: 1試驗(yàn)材料 供試的37個樣品均為云南省野生蘭花,其中14個樣品為建蘭亞屬種類,5個樣品為蘭 亞屬種類,11個樣品為大花亞屬種類,7個樣品為蘭科非蘭屬種類(具體實(shí)驗(yàn)材料見圖、表 編號)。所有材料被引種栽培于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院花卉所溫室蘭花圃中。樣品的 中文學(xué)名和拉丁學(xué)名參照陳心啟(1999)在《中國植物志》和陳心啟等(2003)在《植物分 類學(xué)報》"蘭屬中若干分類群的訂正"中的命名,見表2。
[0072]表2 蘭屬種及部分蘭科其它屬采集資源統(tǒng)計表
2試驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例1相同。
[0073] 3結(jié)果與分析 1隨機(jī)引物BS-5的RAH)擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果如圖(圖7)所示:圖中1~30泳道為蘭屬樣品, 31~37泳道為非蘭屬樣品,可以看出所有蘭屬樣品都具有約為1070bp的特異性條帶,非 蘭屬樣品不具有此特異性條帶。
[0074] 2SCAR標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果 SCAR標(biāo)記的引物PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖(圖8)所示,蘭屬樣本中能夠清晰地擴(kuò)增出約為 1070bp的特異性條帶。 3重組克隆的PCR鑒定結(jié)果 重組克隆的菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖(圖9)所示,6,11,16號泳道所對應(yīng)的樣品為假陽性 克隆,其他樣品均為陽性克隆。
[0075] 4SCAR標(biāo)記序列系統(tǒng)進(jìn)化分析 通過鄰接法分析產(chǎn)生的蘭屬植物系統(tǒng)進(jìn)化樹表明:從整個群體上看,所有樣本明顯的 聚為3支,第一支由春劍、珍珠矮、送春、建蘭、莎葉蘭、大根蘭、兔耳蘭、蕙蘭、墨蘭、蓮瓣蘭、 春蘭、寒蘭、邱北東蕙蘭、落葉蘭和文山紅柱蘭組成;第二支由多花蘭、果香蘭、紋瓣蘭和硬 葉蘭組成;第三支由冬鳳蘭、碧玉蘭、垂花蘭、莎草蘭、美花蘭、長葉蘭、滇南虎頭蘭、大雪蘭、 獨(dú)占春、斑舌蘭和黃蟬蘭組成。
[0076] 以上結(jié)果表明建立的特異SCAR標(biāo)記技術(shù),可區(qū)分出蘭屬不同品種(系)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速鑒定蘭屬植物的方法,其特征在于通過植物基因組DNA的CTAB法提取蘭 屬植物基因組DNA,通過蘭屬植物的隨機(jī)引物BS-5的RAH)擴(kuò)增反應(yīng),以及SCAR標(biāo)記引物的 PCR擴(kuò)增反應(yīng),通過電泳檢測觀測擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物條帶,蘭屬植物樣品都具有約1070bp的 特異性條帶。2. 如權(quán)利要求1所述的快速鑒定蘭屬植物的方法,其特征在于所述的隨機(jī)引物BS-5的 RAF1D擴(kuò)增反應(yīng)引物序列為: BS-5 :5'-TGCGCCCTTC-3' 。3. 如權(quán)利要求1所述的快速鑒定蘭屬植物的方法,其特征在于所述的SCAR標(biāo)記引物的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物序列為: SF: 5'-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3' SW: 5'-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3' 。
【專利摘要】本發(fā)明具體涉及一種快速鑒定蘭屬植物的方法,屬于植物鑒定技術(shù)領(lǐng)域,其特征在于通過植物基因組DNA的CTAB法提取蘭屬植物基因組DNA,通過蘭屬植物的隨機(jī)引物BS-5的RAPD擴(kuò)增反應(yīng),以及SCAR標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng),通過電泳檢測觀測擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物條帶,蘭屬植物樣品都具有約1070bp的特異性條帶。蘭屬植物快速鑒定方法可用于快速檢測大量品種,對蘭花品種的整理、分類研究、澄清品種、種子資源的保護(hù)、分子鑒定以及推動蘭花品種國際登錄體系的建立等都有積極作用。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105112557
【申請?zhí)枴緾N201510663315
【發(fā)明人】王玉英, 李枝林
【申請人】云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年10月15日