快速鑒定蘭屬植物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種快速鑒定蘭屬植物的方法，屬于植物鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 20世紀(jì)末，蘭花業(yè)發(fā)展迅速。栽培群體迅速擴(kuò)大，新品種層出不窮。品種分類方面 仍以傳統(tǒng)瓣型分類為主，現(xiàn)代新興技術(shù)和手段也有所嘗試。運(yùn)用數(shù)量分類方法對(duì)中蘭花品 種分類的研究，R分析初步得出了蘭花花種級(jí)分類的特征性狀和品種分類特征性狀，Q分析 得出了蘭花花種級(jí)分類界線和類型分級(jí)界線。這是蘭花品種分類運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)取得的最大 成果，也對(duì)經(jīng)典形態(tài)分類提供了有力的佐證。國(guó)際上，有關(guān)蘭花品種分類的工作非常少，僅 限于日本和韓國(guó)方面。其現(xiàn)有蘭花品種中有多數(shù)均為中國(guó)原有品種；品種分類也是對(duì)中國(guó) 傳統(tǒng)瓣型分類的延續(xù)。同時(shí)，隨80年代后中國(guó)南方多省對(duì)蘭花葉藝觀賞的興起，日本、韓蘭 花花界人士對(duì)蘭花葉藝類別的說(shuō)明多見(jiàn)，但作為非主流分類方法，并未有相關(guān)系統(tǒng)分類出 現(xiàn)。目前，尚無(wú)系統(tǒng)全面的對(duì)蓮瓣蘭品種分類研究的相關(guān)報(bào)道。
[0003] 自二十世紀(jì)90年代以來(lái)，植物分子系統(tǒng)學(xué)蓬勃發(fā)展，其理論和方法已日益成熟和 完善，相對(duì)于形態(tài)性狀，特別是數(shù)量性狀，分子標(biāo)記和DNA測(cè)序有許多無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。生 物大分子本身就是遺傳進(jìn)化信息的載體和進(jìn)化歷史的累積，信息量大，其變異一般不易受 環(huán)境影響而相對(duì)穩(wěn)定，趨同效應(yīng)弱，所提供的系統(tǒng)進(jìn)化信息更接近客觀自然，所揭示系統(tǒng)發(fā) 育關(guān)系也更具客觀性和可比性?；诨蚝虳NA片段變異或者序列堿基變異位點(diǎn)檢測(cè)值為 基因組的遺傳變異，并根據(jù)所提供的信息進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析已成為目前植物系統(tǒng)學(xué)研究的 主要手段，廣泛地應(yīng)用于植物系統(tǒng)的各級(jí)分類單元上，并取得了重要的研究成果。
[0004]SCAR分子標(biāo)記是一種快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確鑒定植物不同品種的新方法。SCAR標(biāo)記是 以品種的特異序列為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)特異序列設(shè)計(jì)引物，其PCR結(jié)果是一種顯性標(biāo)記，在電泳 圖譜上一般表現(xiàn)為特異片斷的有無(wú)。SCAR標(biāo)記應(yīng)用于品種鑒別時(shí)僅需從標(biāo)準(zhǔn)樣品中選擇陽(yáng) 性和陰性兩個(gè)品種作為對(duì)照即可。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種通過(guò)SCAR標(biāo)記，得到蘭屬植物DNA特異條帶，用以快速 鑒定蘭屬植物的方法。
[0006] 一種快速鑒定蘭屬植物的方法，其特征在于通過(guò)植物基因組DNA的CTAB法提取蘭 屬植物基因組DNA，通過(guò)蘭屬植物的隨機(jī)引物BS-5的RAH)擴(kuò)增反應(yīng)，以及SCAR標(biāo)記引物的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)電泳檢測(cè)觀測(cè)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物條帶，蘭屬植物樣品都具有約1070bp的 特異性條帶。
[0007] 所述的隨機(jī)引物BS-5的RAH)擴(kuò)增反應(yīng)引物序列為： BS-5 :5'-TGCGCCCTTC-3' 。
[0008] 所述的SCAR標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物序列為： SF: 5'-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3' SW: 5'-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3' 。
[0009] 本發(fā)明快速鑒定蘭屬植物的方法，具體通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)： 一.提取蘭屬植物基因組DNA 1) 提取DNA所用的提取液，吸頭，離心管等需要在高壓滅菌鍋中121°C(約1. 1kg/cm) 高壓滅菌20min; 2) 取50mg新鮮的葉片用液氮研磨，磨碎后置于1. 5ml離心管中，加入預(yù)熱的600yL 2XCTAB緩沖液（lOOmMTris-Hcl，pH=8.0;20mMEDTA，PH=8.0;1.4MNaCl;2%CTAB; 2%0-巰基乙醇；5%PVP); 3) 65°C溫浴lh，每隔lOmin輕緩顛倒離心管，使其混勻； 4) 12, 000rpm/min離心lOmin，上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中； 5) 分別用等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1)，氯仿：異戊醇（24:1)各抽提一次。 12, 000rpm/min離心lOmin; 6) 上清液轉(zhuǎn)管，加入等體積的冷的異丙醇，_20°C沉淀2h; 7) 12, 000rpm/min離心lOmin，棄上清液； 8) 沉淀分別用70%乙醇，無(wú)水乙醇各洗滌一次； 9) 將沉淀置于超凈工作臺(tái)上吹干，加入50yL1xTE(10mMTris-Hcl，pH=8.0; ImMEDTA)溶解，放在-20°C備用。
[0010] 二?SCAR標(biāo)記的蘭屬特異片段的擴(kuò)增 1)隨機(jī)引物BS-5的RAH)擴(kuò)增反應(yīng) 引物序列： BS-5 :5'-TGCGCCCTTC-3' PCR反應(yīng)體系25yL: DNA模板 LOyL TaqDNA聚合酶（5U/yL，Takara) 0. 25yL 2. 5mmol/LdNTPs 2. 0yL 10XPCRBuffer(含Mg2+) 2. 5yL BS5 (lOmM/yL) 1. 5yL ddH20 17. 75yL 總體積 25yL PCR的擴(kuò)增程序：
[0011] 2)隨機(jī)引物BS-5擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè) 取10 y L的PCR產(chǎn)物和5 y L Trans 2K Plus DNA Marker分別與2 y L的6 X上樣緩沖 液（25 y L/L花青素）混合均勻后上樣，在1 X TAE緩沖液體系中，經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠，100V 電泳lh ;然后將膠放入IQuant capture凝膠成像分析系統(tǒng)中，進(jìn)行分析并拍照，觀察PCR產(chǎn) 物條帶。
[0012] 3)特異片段的回收 生工生物工程(上海)有限公司Sanpr印柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行特異性片段的割膠 回收。
[0013] (1)用1% (w/v)瓊脂糖凝膠，于新配制的TAE緩沖液中電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (2) 紫外燈下切下目的DNA片段，應(yīng)盡量減少DNA暴露在短波紫外燈的時(shí)間以降低對(duì) DNA的損傷； (3) 將切割的含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠收集于1. 5ml的離心管中，稱重，并按照 lg/lml的比例換算出膠的體積； (4)向離心管中加入Binding BufferII，加入的量為膠體積的3-4倍； (5) 將離心管置于55°C水浴5-10min，間或混勻，直至膠塊完全溶化； (6)將溶化好的溶液全部移入吸附柱，室溫放置2min, 8,OOOrpm離心lmin。倒掉收集 管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中； (7)向吸附柱中加入500yLWash Solution，室溫放置2min，10,OOOrpm離心lmin。倒 掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中，重復(fù)該過(guò)程一次； (8) 將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)，12, 000離心2min，除去吸附柱上殘留的乙醇； (9) 將離心后的吸附柱自然晾干10min，使乙醇揮發(fā)完全； (10) 將吸附柱置于一新1.5ml離心管中，加入30-50yLElutionBuffer，室溫靜置 l_2min，12, 000 離心lmin; (11) 所提DNA經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，取1yLDNA和30ng未經(jīng)酶解的ADNA標(biāo)準(zhǔn) 分別與2yL的6X上樣緩沖液（25yL/L花青素）混勻后上樣，在1XTAE緩沖液體系中， 120V電泳lh;然后將膠放入IQuantcapture凝膠成像分析系統(tǒng)中，進(jìn)行分析并拍照，比較 樣品DNA條帶與ADNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的亮度和寬度即可對(duì)樣品DNA含量進(jìn)行估計(jì)； 4)PCR產(chǎn)物的連接 將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司） 反應(yīng)體系10yL: pMD18-T vecter 0. 5 u L Soloution I 1u L 純化后的PCR產(chǎn)物 5yL ddH20 3. 5 y L 16°C連接過(guò)夜。
[0014] 5)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 采用CaCV法，制備感受態(tài)細(xì)胞的大腸桿菌宿主菌株為DH5a。方法如下： (1) 挑取平板上的大腸桿菌單菌落接種于50mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)過(guò) 夜； (2) 取該菌液以1:100接種于10mL新鮮LB培養(yǎng)液中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)至0D6QQ=0. 4~ 0. 6 (或菌液成輕微云霧狀）； (3) 將菌液移到滅菌的1. 5mL的離心管中，lmL/管，8000rpm，離心5min，棄上清液； (4) 加入預(yù)冷的0.1MCaCl2 500yL/管，洗滌2次，懸浮，12000rpm，離心5min， 棄上清液； (5) 加入預(yù)冷的0.1MCaCl2 100yL，懸浮，30min后使用。
[0015] 6)轉(zhuǎn)化 (1) 取10y1的連接產(chǎn)物加入到裝有100y1感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以混勻 內(nèi)容物，冰浴30min; (2) 將離心管放入42°C的水浴鍋中熱激90秒，快速轉(zhuǎn)至冰浴中l(wèi)Omin; (3) 加入500y1LB液體培養(yǎng)基，于37°C，170rpm震蕩培養(yǎng)lh; (4) 取100mL涂布于含有氨芐青霉素的麥康凱固體培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限 公司）上，于室溫下至涂布的菌液被培養(yǎng)基吸干，倒置培養(yǎng)皿，于37°C培養(yǎng)18~24h; (5) 挑取白斑。
[0016] 7)重組克隆的PCR鑒定 挑取PCR陽(yáng)性菌落