一株多溴聯(lián)苯醚單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株多溴聯(lián)苯醚單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免 疫學(xué)檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 多溴聯(lián)苯醚（PBDEs)作為一種溴系阻燃劑的一大類阻燃物質(zhì)，由于其優(yōu)異的阻燃 性能，已經(jīng)越來越廣泛的應(yīng)用于各種消費產(chǎn)品當(dāng)中。同時，多溴聯(lián)苯醚（PBDEs)也是一類全 球性的有機污染物，由于其持久性、毒性和潛在的生物蓄積性而備受關(guān)注，光化學(xué)降解是環(huán) 境中多溴聯(lián)苯醚的重要歸趨之一，隨著在環(huán)境樣品中不斷報道PBDEs的檢出，該類化合物 所造成的環(huán)境問題也越來越受到大家特別是環(huán)境科學(xué)的關(guān)注。
[0003] 目前檢測多溴聯(lián)苯醚的方法主要有氣相色譜/電子捕獲檢測法（GC/E⑶)，氣 相色譜-負化學(xué)電離源質(zhì)譜法（GC-NCI-MS)，液相色譜法（HPLC)，氣質(zhì)聯(lián)用法（GC/MS)等方 法，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較貴等缺點，不能實現(xiàn)大量樣品的快速檢測， 因此建立一種快速簡便的多溴聯(lián)苯醚檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（ELISA)是一種 極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大 量樣本的現(xiàn)場快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株多溴聯(lián)苯醚單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備 的抗體對多溴聯(lián)苯醚具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立多溴聯(lián)苯醚的免疫學(xué)檢 測方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案，一株多溴聯(lián)苯醚單克隆抗體雜交瘤細胞株，其命名為1A1，已 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 10861。
[0006] 多溴聯(lián)苯醚單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCCNo. 10861的多溴聯(lián)苯醚單 克隆抗體雜交瘤細胞株IAl所分泌產(chǎn)生。
[0007] 所述多溴聯(lián)苯醚單克隆抗體雜交瘤細胞株IAl的制備，基本步驟如下： (1)半抗原的合成： ①將 2, 4-二溴苯酚（I. 04g，4. 13mmol)溶于 8mLDMF溶液中，加入NaH(0? 2g， 8. 33mmol)，冰浴攪拌30min，然后靜置至室溫；保持室溫15min之后，加入3-溴-4-氟硝 基苯（I. 01g，4. 13mmol)，90°C加熱回流 2h;加入IOmL水，用CH2Cl2 (4X20mL)萃取，有 機相再用水（25mL)萃取，然后用無水硫酸鎂干燥有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑；采用硅膠 柱層析純化，用乙醚：正己烷體積比為50 : 50混合溶劑洗脫，得到橙黃色液體4'-硝 基-2, 2'，4-三溴聯(lián)苯醚。
[0008]②采用Fe/H+硝基還原方法，還原劑鐵粉（5. 0mmol)和4'-硝基-2, 2'，4-三 溴聯(lián)苯醚（5. 0mmol)加入到乙醇（IOmL)和乙酸（IOmL)的混合溶劑中，在80°C條件下反應(yīng) 約Ih;反應(yīng)完全后冷卻至室溫，過濾，液相中加入30mL的乙酸乙酯和30mL的水，分離出有 機相，水相用乙酸乙酯（30mLX2 )萃取，合并有機相，依次用IMNa2CO3水溶液（30mLX2 )和 水（30mLX3)洗滌，有機相經(jīng)無水硫酸鎂干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑；經(jīng)柱層析分離 后得到純樣品，柱層析展開劑：乙酸乙酯：正己烷體積比為1 : 2,得到淡黃色固體4'-氨 基-2, 2'，4-三溴聯(lián)苯醚。
[0009] ③4'-氨基-2, 2'，4-三溴聯(lián)苯醚（170.lmg，0. 37mmol)，溶于3mL無水P比啶中，加 入琥珀酸酐（78mg，0. 78mmol)，60°C加熱回流過夜；反應(yīng)完全后冷卻至室溫，2M鹽酸溶液 酸化，用二氯甲燒萃?。?mLX4)，再加入2mL2MNaOH萃??；分離水相，冷卻，酸化至pH=2， 產(chǎn)生白色沉淀，得到5-[4-(2, 4-二溴苯氧基）-3-溴苯基]甲酰胺丁酸，即為半抗原； (2)完全抗原的合成：稱取45. 2mg5-[4-(2, 4-二溴苯氧基）-3-溴苯基]甲酰胺丁酸，EDC(碳二亞胺）38. 3mg，NHS(N-羥基琥珀酰亞胺）23.Omg，用ImL無水DMF溶解(稱為A 液)，室溫攪拌反應(yīng)8h。稱取BSA(牛血清蛋白）112mg溶于20mLpH7.4的0?Olmol/LPBS中 (稱為B液)，在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，得到偶聯(lián)物PBDEs-BSA 混合液即為多溴聯(lián)苯醚完全抗原，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通 過紫外吸收掃描方法鑒定； (3 )小鼠的免疫：多溴聯(lián)苯醚完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射 免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免 之間間隔一個月，加強免3次，加強免之間間隔21天。最后用多溴聯(lián)苯醚完全抗原(不含佐 劑）沖擊免疫；通過間接ELISA檢測血清效價和抑制； (4) 細胞融合與細胞株建立：通過聚乙二醇（PEG4000)法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤 細胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭 ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三 次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株IAl; (5) 雜交瘤細胞株性質(zhì)的鑒定：通過ELISA法測定靈敏度和特異性。
[0010] 所述多溴聯(lián)苯醚單克隆抗體的應(yīng)用：用于食品安全中多溴聯(lián)苯醚的殘留檢測。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明獲得的多溴聯(lián)苯醚單克隆抗體雜交瘤細胞株1A1，即 CGMCCNo. 10861，由其分泌的多溴聯(lián)苯醚單克隆抗體對多溴聯(lián)苯醚有較好的檢測靈敏度 和特異性（IC5。值為20yg/L)，用于食品安全中多溴聯(lián)苯醚的殘留檢測。
[0012] 生物材料樣品保藏：單克隆細胞株，其命名為1A1，已保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研 究所，保藏編號為CGMCCNo. 10861，保藏日期為2015年5月19日。
【附圖說明】
[0013] 圖1是IAl單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0014] 本發(fā)明下面的實施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi) 容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0015] 本發(fā)明通過將多溴聯(lián)苯醚完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培 養(yǎng)，通過間接ELISA和間接競爭ELISA篩選細胞上清，最終得到了對多溴聯(lián)苯醚有較好特異 性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0016] 實施例1雜交瘤細胞株IAl的制備 (1)完全抗原的合成 將 2, 4-二溴苯酚（I. 04g，4. 13mmol)溶于 8mLDMF溶液中，加入NaH(0. 2g，8. 33mmol)， 冰浴攪拌30min，然后靜置至室溫；保持室溫15min之后，加入3-溴-4-氟硝基苯（I.Olg， 4. 13mmol)，90°C加熱回流2h;加入10mL7K，用CH2Cl2每次20mL萃取4次，有機相再用25mL 水萃取，然后用無水硫酸鎂干燥有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑；采用硅膠柱層析純化，用乙 醚：正己烷體積比為50 : 50混合溶劑洗脫，得到橙黃色液體4' -硝基-2, 2'，4-三溴聯(lián) 苯醚。
[0017]米用Fe/H+硝基還原方法，還原劑鐵粉5. 0mmol和4'-硝基_2, 2'，4_二漠聯(lián)苯 醚5. 0mmol加入到乙醇IOmL和乙酸IOmL的混合溶劑中，在80°C條件下反應(yīng)約Ih;反應(yīng)完 全后冷卻至室溫，過濾，液相中加入30mL的乙酸乙酯和30mL的水，分離出有機相，水相用 乙酸乙酯每次30mL萃取2次，合并有機相，依次用IMNa2CO3水溶液每次30mL洗2次和水 每次30mL洗滌3次，有機相經(jīng)無水硫酸鎂干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑；經(jīng)柱層析分離 后得到純樣品，柱層析展開劑：乙酸乙酯：正己烷體積比為1 : 2,得