牛膝糖聚合物及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥及保健食品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物中糖聚合物的制備方法，更 具體的說(shuō)涉及懷牛膝粗糖聚合物、精糖聚合物的制備方法，還涉及該牛膝粗糖聚合物在預(yù) 防和/或治療骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用。本發(fā)明中的糖聚合物包括多糖和寡糖。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis, 0P)是一種以骨礦物量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨強(qiáng)度 降低，從而導(dǎo)致骨的脆性增加和易于發(fā)生骨折為特征的疾病。骨質(zhì)疏松癥是一種多發(fā)性的 老年性疾病，隨著人口的老齡化日趨嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥已嚴(yán)重危害老年人健康。絕經(jīng)后女性 因受到衰老和體內(nèi)激素水平下降的雙重影響，成為該病最大的受害人群，約占總患病人數(shù) 70%以上。目前防治骨質(zhì)疏松癥的藥物主要是骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑和礦化藥物，這 些藥物均屬替代治療，在長(zhǎng)期使用過(guò)程中，具有毒副作用大，靶向性低，依從性差，費(fèi)用高等 缺點(diǎn)。因此，有必要找尋到一種高效、低毒的藥物來(lái)治療骨質(zhì)疏松癥。中藥在治療骨質(zhì)疏松 癥方面具有悠久歷史，具有全身調(diào)理、毒副作用小、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的關(guān) 注。而在眾多中藥中，補(bǔ)腎壯骨類(lèi)中藥由于良好的療效一直受到人們的青睞。
[0003] 牛膝（B. 1)為莧科植物牛膝的干燥根，為"四大懷藥"之 一。具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行之功，主要用于腰膝酸痛、筋骨無(wú)力、經(jīng)閉癥 瘕、肝陽(yáng)眩暈之癥。歷代本草明確記載治療"骨痹"、"骨痿"的方劑共21個(gè)，涉及藥物77種， 其中牛膝出現(xiàn)11次。牛膝糖聚合物作為牛膝的主要活性成分之一，已被報(bào)道具有免疫調(diào) 節(jié)、抗腫瘤、降血糖、保護(hù)肝腎等多種藥理活性。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)牛膝糖聚合物的研究主要集中在其抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降 糖、抗衰老等方面的活性研究，對(duì)其在防治骨質(zhì)疏松癥方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種牛膝糖聚合物ABW3-1。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種牛膝中糖聚合物的提取方法。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述牛膝糖聚合物在制備防治骨質(zhì)疏松藥物或保健 食品或功能食品中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種牛膝糖聚合物ABW3 -1，該糖聚合物是由葡萄糖和果糖組成的寡糖，其結(jié)構(gòu)為：
[0009] -種牛膝中糖聚合物的提取方法，該方法包括以下操作步驟： 1) 剪切：將牛膝干燥根切成小段，用水清洗干凈、晾干； 2) 水提：將剪切好的牛膝進(jìn)行水提，分別收集提取液和殘?jiān)?3) 分級(jí)醇沉：將提取液濃縮后，加入乙醇使乙醇體積濃度為a%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB1 ;將上清液再次濃縮，加入乙醇使乙醇體積濃度為b%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB2 ;將上清液再次濃縮，加入乙醇使乙醇體積濃度為c%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB3 ;其中10彡a<b<c< 100 ; 4) 堿提：將水提后的殘?jiān)萦?. 1~1MNaOH溶液中，靜置1~4h，上清液用0. 1~ 1MHC1進(jìn)行中和，使上清液的pH為6~8,離心取上清，濃縮上清，加入乙醇使乙醇體積濃 度為50~90%，靜置，收集沉淀，即得堿提粗糖聚合物ABB; 5) 純化：對(duì)上述粗糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB進(jìn)行純化，即得牛膝糖聚合物。
[0010] 進(jìn)一步的，步驟2)中所述水提的具體操作為用5~15倍體積的60~100°C熱水對(duì) 切好的牛膝進(jìn)行提取，提取時(shí)間1~4h。
[0011] 進(jìn)一步的，步驟3)中所有所述濃縮為40~70°C減壓濃縮，所有所述靜置的時(shí)間為 10 ~28h〇
[0012] 進(jìn)一步的，步驟 3)中 10 彡a< 60,60 <b< 80,80 <c< 100。
[0013] 進(jìn)一步的，將步驟5)中純化后的糖聚合物AB3再進(jìn)行離子交換柱層析，用蒸餾水 進(jìn)行洗脫，使用苯酚-硫酸法跟蹤洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集糖部分，濃縮，冷凍干燥；然 后用水溶解，離心，取上清液進(jìn)行分子篩凝膠柱層析，用水進(jìn)行洗脫，使用苯酚-硫酸法跟 蹤洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集糖部分，濃縮，冷凍干燥后獲得牛膝糖聚合物ABW3-1。
[0014] 牛膝糖聚合物，該糖聚合物的提取方法為上述所述的提取方法。
[0015] 牛膝糖聚合物ABW3-1在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物或保健食品或功能食品中的應(yīng) 用。
[0016] 牛膝糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物或保健食品或功能 食品中的應(yīng)用。
[0017] 牛膝糖聚合物在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物或保健食品或功能食品中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的有益效果是： 1.本發(fā)明利用離子交換層析和分子篩凝膠柱層析方法純化牛膝糖聚合物，首次制備 出一種牛膝精寡糖，并且對(duì)該精寡糖的理化性質(zhì)、分子量、單糖組成等進(jìn)行了系統(tǒng)的分析鑒 定，并成功得出了該寡糖的特征結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供了牛膝中粗糖聚合物、精糖聚合物的制備 方法及牛膝糖聚合物在抗骨質(zhì)疏松方面的活性研究，為牛膝糖聚合物在醫(yī)藥、保健品等領(lǐng) 域的應(yīng)用提供依據(jù)。
[0019] 2.與傳統(tǒng)水煮法提取糖聚合物相比，本發(fā)明采用水提醇沉法和堿提法的結(jié)合，乙 醇濃度由低到高進(jìn)行分級(jí)醇沉，對(duì)牛膝糖聚合物進(jìn)行初步分離，同時(shí)高濃度乙醇能將極性 大、水溶性好的糖聚合物與極性小、水溶性差的糖聚合物分離，使所提取的糖聚合物組合物 含有更多種類(lèi)的糖聚合物成分。且本制備工藝簡(jiǎn)單，操作方便，且可以大規(guī)模生產(chǎn)。
[0020] 3.本發(fā)明中通過(guò)柱層析法對(duì)牛膝粗糖聚合物進(jìn)行分離純化，效果顯著，首次制備 出一種牛膝寡糖純品。
[0021] 4.本發(fā)明對(duì)制備出的一種牛膝寡糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，明確了該寡糖的理化性質(zhì) 及結(jié)構(gòu)，為探究其藥理活性機(jī)制提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。
[0022] 5.本發(fā)明提供了牛膝中具有抗骨質(zhì)疏松活性的成分的制備方法，并且篩選出了 含量高、活性強(qiáng)的糖聚合物部位。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖 1 為ABW3-1 的HPGPC色譜圖； 圖2為ABW3-1的紅外圖譜； 圖3為ABW3-1的13CNMR圖譜； 圖4為ABW3-1的1HNMR圖譜； 圖5為ABW3-1的HSQC圖譜； 圖6為ABW3-1的HMBC圖譜； 圖7為牛膝糖聚合物對(duì)去卵巢大鼠體重的影響； 圖8為牛膝糖聚合物對(duì)去卵巢大鼠子宮系數(shù)的影響； 圖9為牛膝糖聚合物對(duì)去卵巢大鼠股骨骨密度的影響； 圖10為牛膝糖聚合物對(duì)去卵巢大鼠腰椎骨骨密度的影響； 圖11為牛膝糖聚合物對(duì)去卵巢大鼠股骨骨礦物量的影響； 圖12為牛膝糖聚合物對(duì)去卵巢大鼠腰椎骨骨礦物量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 1.牛膝中糖聚合物的提取方法，該方法包括以下操作步驟： 1) 剪切：將牛膝干燥根切成小段，用冷水快速清洗、晾干； 2) 水提：將剪切好的牛膝進(jìn)行水提，分別收集提取液和殘?jiān)?3) 分級(jí)醇沉：將提取液濃縮后，加入乙醇使乙醇體積濃度為a%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB1 ;將上清液再次濃縮，加入乙醇使乙醇體積濃度為b%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB2 ;將上清液再次濃縮，加入乙醇使乙醇體積濃度為c%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB3 ;其中10彡a<b<c< 100 ;更優(yōu)選的10彡a<b<c< 100,且10彡a < 60,60 <b< 80,80 <c< 100 ； 4) 堿提：將水提后的殘?jiān)萦?. 1~1MNaOH溶液中，靜置1~4h，上清液用0. 1~ 1MHC1進(jìn)行中和，使上清液的pH為6~8,離心取上清，濃縮上清，加入乙醇使乙醇體積濃 度為50~90%，靜置，收集沉淀，即得堿提粗糖聚合物ABB; 5)純化：對(duì)上述粗糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB進(jìn)行純化，即得牛膝糖聚合物。
[0025] 優(yōu)選的，步驟1)中所述小段為1~2cm的小段。
[0026] 優(yōu)選的，步驟2)中所述水提的具體操作為用5~15倍體積的60~100°C熱水對(duì)牛 膝進(jìn)行提取，提取時(shí)間1~4h。
[0027] 優(yōu)選的，步驟3)中所有所述濃縮為40~70°C減壓濃縮，所有醇沉靜置的時(shí)間為 10 ~28h〇
[0028] 優(yōu)選的，步驟4)中NaOH溶液用量體積為殘?jiān)w積的10~20倍。
[0029] 優(yōu)選的，步驟5)中所述純化具體操作為利用Sevag法分別對(duì)粗糖聚合物AB1、AB2、 AB3、ABB除蛋白，除蛋白后再經(jīng)透析袋進(jìn)行透析、凍干。
[0030] 優(yōu)選的，上述透析袋的截留分子量為3000Da。
[0031] 優(yōu)選的，對(duì)步驟5)中純化后的