一種利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)花生及制品中黃曲霉毒素潛在污染風(fēng)險(xiǎn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)花生及制品中黃曲霉毒素潛在 污染風(fēng)險(xiǎn)的方法，屬于食品安全與檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生在中國(guó)的種植面積為500萬(wàn)公頃，年產(chǎn)量為1400萬(wàn)噸，占世界花生總產(chǎn)量的 40%以上，居世界第一位，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。目前我國(guó)花生及其制品中黃曲霉毒 素污染水平已達(dá)到了 23~500 μ g/kg，大大超出了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定限值，嚴(yán)重影響著花生 制品的食用安全性和國(guó)際貿(mào)易，黃曲霉毒素污染已成為制約花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展和食用安全的最 大限制因子?；ㄉS曲霉毒素污染嚴(yán)重，其主要原因是花生在收獲、加工、運(yùn)輸、貯藏過(guò)程中 很容易受到黃曲霉菌的侵染而產(chǎn)生黃曲霉毒素，造成花生黃曲霉毒素污染超標(biāo)。開發(fā)快速、 靈敏的黃曲霉毒素產(chǎn)生菌株檢測(cè)方法，用于花生原料和加工過(guò)程中的檢驗(yàn)可避免或減少黃 曲霉素污染風(fēng)險(xiǎn)。
[0003] 花生及制品中黃曲霉毒素潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)主要來(lái)源于黃曲霉毒素產(chǎn)生菌，判斷其 存在的潛在污染風(fēng)險(xiǎn)主要是看樣品中是否含有黃曲霉毒素產(chǎn)生菌，而黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的 檢測(cè)目前主要是通過(guò)形態(tài)觀察和生理分析，形態(tài)觀察主要是個(gè)體形態(tài)和菌落特征，生理分 析主要分析培養(yǎng)條件以及產(chǎn)生毒素的種類。這些常規(guī)方法易受到實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的干 擾，從而影響鑒定結(jié)果，且鑒定花費(fèi)的時(shí)間也較長(zhǎng)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā) 展，越來(lái)越多的學(xué)者開始利用分子生物學(xué)手段對(duì)某一未知菌進(jìn)行鑒定及分類研究。普通PCR 存在操作步驟繁瑣、容易造成污染、難以準(zhǔn)確定量檢測(cè)不足，而熒光定量PCR方法是在傳統(tǒng) PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高和易操作 等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 黃曲霉毒素的生物合成過(guò)程非常復(fù)雜，共涉及到21步酶促反應(yīng)。迄今為止，大 部分與黃曲霉毒素及其前體柄曲霉素（sterigmatocystin，ST)生物合成相關(guān)的酶促反 應(yīng)已為人們所認(rèn)識(shí)，這些酶的編碼基因也相繼被克隆。參與黃曲霉毒素合成的絕大多數(shù) 基因聚集于某特定基因簇中，其中包括黃曲霉毒素生物合成途徑調(diào)芐基因 （aflatoxin biosynthetic pathway regulatory gene, aflR)，該基因?yàn)槠渌麉⑴c黃曲霉毒素合成的基 因表達(dá)所必需。
[0005] 發(fā)明專利（201210584285. 9)公布了一種利用多重PCR技術(shù)分析花生柏中黃曲霉 毒素 Bl產(chǎn)生趨勢(shì)的方法，通過(guò)條帶的豐富度來(lái)確定黃曲霉毒素 Bl產(chǎn)生趨勢(shì)，該專利通過(guò)條 帶的豐富度來(lái)判斷黃曲霉毒素 Bl產(chǎn)生趨勢(shì)，存在判斷標(biāo)準(zhǔn)不精確，無(wú)法進(jìn)行定量判斷的缺 點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了準(zhǔn)確快速地判斷花生及其制品黃曲霉毒素潛在污染風(fēng)險(xiǎn)，為花生及制品的食 品安全提供技術(shù)支撐，本發(fā)明提供了一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)花生及制品中黃 曲霉毒素潛在污染風(fēng)險(xiǎn)的方法，利用熒光定量PCR技術(shù)、通過(guò)黃曲霉毒素合成關(guān)鍵基因的 特異性引物進(jìn)行檢測(cè)，建立了黃曲霉毒素污染風(fēng)險(xiǎn)與熒光定量Ct值的關(guān)系模型。
[0007] 為達(dá)到上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括步驟：
[0008] (1)基因組DNA的提取：采用四分法采集花生樣品0. lg，采用氯化芐法提取DNA， 得到粗DNA后，用DNA純化試劑盒純化后，用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)濃度，稀釋至30ng/uL，存 于-20°C備用。
[0009] (2)以基因組DNA為模板，以黃曲霉菌產(chǎn)毒關(guān)鍵基因 AFLR為目標(biāo)基因，特異性引物 為上游引物 5' -AACCTGATGACGACTGATAT-3'，下游 5' -AGCACCTTGAGAACGATAA-3'，進(jìn)行熒光 定量PCR反應(yīng)。
[0010] (3)根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果判斷花生及制品中是否感染黃曲霉毒素產(chǎn)生菌，當(dāng)有 擴(kuò)增曲線時(shí)，判斷花生及制品感染黃曲霉毒素產(chǎn)生菌；未有擴(kuò)增曲線，判斷花生及制品未感 染黃曲霉毒素產(chǎn)生菌。
[0011] ⑷根據(jù)樣品熒光定量PCR的Ct值來(lái)判斷花生及制品黃曲霉毒素的含量，花生樣 品中的黃曲霉毒素含量和Real-time PCR的Ct值呈顯著的負(fù)相關(guān)，數(shù)學(xué)關(guān)系方程式為：
[0012] y =-0· 0852χ+27· 257。（X 為黃曲霉毒素含量）
[0013] 優(yōu)選地，一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)花生及制品中黃曲霉毒素潛在污染 風(fēng)險(xiǎn)的方法步驟（2)中熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：
[0015] 熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：95 °C 30s，1個(gè)循環(huán)；95 °C 5s，60 °C 34s，40個(gè)循； 95〇C 15s,60〇C 60s, 95〇C 30s〇
[0016] 優(yōu)選地，一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)花生及制品中黃曲霉毒素潛在污染 風(fēng)險(xiǎn)的方法于步驟（4)所述的花生樣品中的黃曲霉毒素含量和Real-time PCR的Ct值的 關(guān)系方程式，X (黃曲霉毒素）線性范圍為0-60, Ct值越低，花生及制品中黃曲霉毒素含量 越大或者受黃曲霉毒素污染風(fēng)險(xiǎn)越高。
[0017] 本發(fā)明的有益效果如下
[0018] (1)本發(fā)明特異性強(qiáng)，只對(duì)含有AFLR基因的菌株產(chǎn)生擴(kuò)增，而對(duì)不含有AFLR基因 的菌株未有擴(kuò)增。
[0019] (2)本發(fā)明靈敏度高，只要含有AFLR基因，均能有擴(kuò)增結(jié)果。
[0020] (3)本發(fā)明穩(wěn)定性好，檢測(cè)結(jié)果安全可靠。
[0021] (4)本發(fā)明能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)黃曲霉毒素產(chǎn)生菌，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在4_8h內(nèi)可 完成，適合大批量檢測(cè)。
[0022] (5)本發(fā)明不僅能判斷產(chǎn)毒菌的存在，而且能定量判斷判斷出花生及制品受黃曲 霉毒素污染風(fēng)險(xiǎn)大小。
[0023] (6)本發(fā)明不僅可以檢測(cè)花生及其制品，也可檢測(cè)加工過(guò)程中的加工品，可應(yīng)用于 花生加工過(guò)程中黃曲霉毒素的污染防控。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是黃曲霉菌AFLR引物的熒光定量PCR反應(yīng)圖
[0025] 圖2是不同濃度黃曲霉DNA的Real-time PCR擴(kuò)增曲線
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)花生及制品中黃曲霉毒素污染風(fēng)險(xiǎn)的方 法特異性好。
[0027] 根據(jù)Genebank公布的AFLR基因序列，應(yīng)用Primer Premier5. 0軟件設(shè) 計(jì)了特異性引物，其序列為：上游引物5' -AACCTGATGACGACTGATAT-3'，下游引物 5'-AGCACCTTGAGAACGATAA-3'，由圖1可以看出，用設(shè)計(jì)的引物對(duì)黃曲霉做Real-time PCR， 無(wú)雜峰，產(chǎn)物平行性好。
[0028] 對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒菌和黃曲霉不產(chǎn)毒菌（不含有AFLR基因）做了特異性驗(yàn)證，結(jié)果 顯示該引物只對(duì)含有AFLR基因的菌株產(chǎn)生擴(kuò)增，而對(duì)不含有AFLR基因的菌株未有擴(kuò)增，表 明該引物特異性較強(qiáng)，適合于黃曲霉產(chǎn)毒菌的檢測(cè)。
[0029] 實(shí)施例2--實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)花生及制品中黃曲霉毒素污染風(fēng)險(xiǎn)的方 法靈敏度高
[0030] 用核酸蛋白分析儀測(cè)量黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的含量后，進(jìn)行10倍倍比稀釋，得 至Ij 3X10 2、3 X 10 3、3X10 4、3X10 5、3X10 6、3 XlO 7、3X10 8、3X10 9、3X10 10、3 X 10 n、 3X10 12、3X10 13DNA濃度的模板，分別作為Real-time PCR的DNA模板，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果