用于木材加工的果膠酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種用于木材加工的果膠酶，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
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[0002]果膠酶是指能分解果膠質(zhì)的一類酶的總稱，果膠酶主要用于飲料、葡萄酒等食品工業(yè)，但隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，生物制漿、生物分離纖維和生物紡織等日益受到了重視和關(guān)注，但目前市場(chǎng)上的果膠酶多為食品加工專用的酸性果膠酶和針對(duì)紡織工業(yè)而研制的堿性果膠酶。木質(zhì)材料不僅具有自己特殊的化學(xué)成分，均可對(duì)生物酶產(chǎn)生抑制作用，還有自己特有的酸堿環(huán)境，也會(huì)對(duì)生物酶產(chǎn)生不利影響。內(nèi)生菌是一種完全適應(yīng)植物內(nèi)部酸堿環(huán)境和化學(xué)成分的一類特殊的微生物，其在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中與其宿主植物協(xié)同進(jìn)化，所以從植物內(nèi)生菌中篩選出可以適應(yīng)植物內(nèi)部環(huán)境，應(yīng)用于木材加工的高效果膠酶。另一方面，果膠質(zhì)是陸生植物中的關(guān)鍵物質(zhì)，分布于細(xì)胞的胞間層和初生細(xì)胞壁中，和無(wú)機(jī)鹽Ga2+形成了螯合物，組成了類似于“蛋殼”的結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞壁的發(fā)育起著支撐作用，在細(xì)胞發(fā)育成熟后又與纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等形成了復(fù)雜的化學(xué)鍵。所以，由于果膠質(zhì)的存在，當(dāng)木質(zhì)材料用于制漿造紙、紡織、纖維分離、酒精制備、納米纖維素制備時(shí)均增加了難度。
[0003]本發(fā)明提供的用于木材加工的果膠酶，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明相同的公開(kāi)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而是提供一種完全適應(yīng)植物內(nèi)部環(huán)境、用于木材加工的果膠酶。
[0005]本發(fā)明的用于木材加工的果膠酶，如下步驟得到:
[0006]a.出發(fā)菌株:甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)HS047，保藏編號(hào)CCTCC M 2015032 ;保藏時(shí)間:2015年I月11日，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址:中國(guó)、武漢、武漢大學(xué)。
[0007]b.種子菌體培養(yǎng)
[0008]種子培養(yǎng)基組成:以g/1000ml計(jì)，果膠4g，酵母粉4g，麥芽粉3g，瓊脂粉14g，用蒸餾水配至1000ml，用滅菌鍋在121°C條件下滅菌30min后，用傾斜法倒至經(jīng)滅菌鍋121°C條件下滅菌60min并已干燥的培養(yǎng)皿中；
[0009]種子菌體培養(yǎng):待種子培養(yǎng)基冷卻，將菌體用竹簽接種于培養(yǎng)皿的種子培養(yǎng)基上，在30_37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用于種子菌體的培養(yǎng)；
[0010]C.發(fā)酵培養(yǎng)
[0011]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，以g/1000ml計(jì)，果膠酶底物0.4g，葡萄糖3.6g，酵母粉4g,麥芽粉3g, MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g用蒸餾水配至1000ml，利用0.01% HCl調(diào)pH值至6.0 ;后分裝于250ml的錐形瓶中，每瓶裝200ml的培養(yǎng)基，在121°C條件下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后；將13步驟的菌齡為24h的菌體，用竹簽接種I環(huán)至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床溫度30-37°C、轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵24h得到果膠酶的粗酶液；將果膠酶粗酶液利用離心機(jī)和超濾膜初步分離純化后，利用DNS法進(jìn)行果膠酶酶活的測(cè)試；
[0012]發(fā)酵培養(yǎng)基中的果膠酶底物為:果膠、或柚子粉、或木粉、或麩皮粉、或大麻桿粉。
[0013]本發(fā)明的用于木材加工的果膠酶，其果膠酶的性能參數(shù)為:最適使用溫度為45°C、最適pH值為4.0-5.5、在溫度4°C或以下溫度儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)間為24_72h ;在37°C條件下儲(chǔ)存時(shí)，儲(chǔ)存時(shí)間不能超過(guò)48h。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0015]1、利用完全適應(yīng)植物內(nèi)部環(huán)境的內(nèi)生菌為出發(fā)菌株，制備出在pH值4.5-5.5環(huán)境能夠充分發(fā)揮果膠酶活性的果膠酶溶液，對(duì)于實(shí)現(xiàn)、促進(jìn)木質(zhì)材料的生物加工奠定基礎(chǔ)。
[0016]2、能高效用于木材加工的果膠酶，對(duì)于實(shí)現(xiàn)生物制漿、綠色纖維分離和生物紡織均具有一定的推動(dòng)和促進(jìn)作用。
【具體實(shí)施方式】
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[0017]實(shí)施例1:
[0018]本發(fā)明的一種用于木材加工的果膠酶，經(jīng)如下步驟得到:
[0019]a.出發(fā)菌株:甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)HS047，保藏編號(hào)CCTCC M 2015032 ;保藏時(shí)間:2015年I月11日，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址:中國(guó)、武漢、武漢大學(xué)。
[0020]b.種子菌體培養(yǎng)
[0021]種子培養(yǎng)基組成:以g/1000ml計(jì)，果膠4g，酵母粉4g，麥芽粉3g，瓊脂粉14g，用蒸餾水配至1000ml，用滅菌鍋在121°C條件下滅菌30min后，用傾斜法倒至經(jīng)滅菌鍋121°C條件下滅菌60min并已干燥的培養(yǎng)皿中；
[0022]種子菌體培養(yǎng):待種子培養(yǎng)基冷卻，將菌體用竹簽接種于培養(yǎng)皿的種子培養(yǎng)基上，在30°C或33°C或37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用于種子菌體的培養(yǎng)；
[0023]c.發(fā)酵培養(yǎng)
[0024]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，以g/1000ml計(jì)，果膠0.4g，葡萄糖3.6g，酵母粉4g,麥芽粉3g, MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g用蒸餾水配至1000ml，利用0.01% HCl調(diào)pH值至6.0 ;后分裝于250ml的錐形瓶中，每瓶裝200ml的培養(yǎng)基，在121°C條件下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后；將13步驟的菌齡為24h的菌體，用竹簽接種I環(huán)至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床溫度30°C或33°C或37°C、轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵24h得到果膠酶的粗酶液；將果膠酶粗酶液利用離心機(jī)和超濾膜初步分離純化后，利用常規(guī)DNS法進(jìn)行果膠酶酶活的測(cè)試，果膠酶酶活(u/ml)為 15.66±0.3。
[0025]實(shí)施例2:
[0026]基本同實(shí)施例1。不同之處為:發(fā)酵培養(yǎng)基中的果膠酶底物為麩皮粉或柚子粉。利用常規(guī)DNS法進(jìn)行果膠酶酶活的測(cè)試，果膠酶酶活(u/ml)為8.73±0.3。
[0027]實(shí)施例3:
[0028]基本同實(shí)施例1。不同之處為:發(fā)酵培養(yǎng)基中的果膠酶底物為木粉。利用常規(guī)DNS法進(jìn)行果膠酶酶活的測(cè)試，果膠酶酶活(u/ml)為0.32±0.3。
[0029]實(shí)施例4:
[0030]基本同實(shí)施例1。不同之處為:發(fā)酵培養(yǎng)基中的果膠酶底物為工業(yè)大麻桿粉。利用常規(guī)DNS法進(jìn)行果膠酶酶活的測(cè)試，果膠酶酶活(u/ml)為8.09±0.3。
[0031]發(fā)明人將上述實(shí)施例得到的果膠酶，用常規(guī)DNS法在不同溫度、不同pH值、不同儲(chǔ)存溫度下測(cè)試果膠酶的酶活，得到果膠酶的性能參數(shù)為:最適使用溫度為45°C、最適pH值為4.0-5.5、在溫度4°C或以下溫度儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)間為24-72h ;在37°C條件下儲(chǔ)存時(shí)，儲(chǔ)存時(shí)間不能超過(guò)48h。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于木材加工的果膠酶，其特征在于該果膠酶經(jīng)如下步驟得到: a.出發(fā)菌株:甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)HS047，保藏編號(hào)CCTCC M 2015032 ； b.種子菌體培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基組成:以g/1000ml計(jì)，果膠4g，酵母粉4g，麥芽粉3g，瓊脂粉14g，用蒸餾水配至1000ml，用滅菌鍋在121°C條件下滅菌30min后，用傾斜法倒至經(jīng)滅菌鍋121°C條件下滅菌60min并已干燥的培養(yǎng)皿中； 種子菌體培養(yǎng):待種子培養(yǎng)基冷卻，將菌體用竹簽接種于培養(yǎng)皿的種子培養(yǎng)基上，在30-37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用于種子菌體的培養(yǎng)； c.發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，以g/1000ml計(jì)，果膠酶底物0.4g，葡萄糖3.6g，酵母粉4g,麥芽粉3g，MgSO40.5g，NaCl 0.5g用蒸餾水配至1000ml，利用0.01% HCl調(diào)pH值至6.0 ;后分裝于250ml的錐形瓶中，每瓶裝200ml的培養(yǎng)基，在121°C條件下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后；將13步驟的菌齡為24h的菌體，用竹簽接種I環(huán)至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床溫度30-37°C、轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵24h得到果膠酶的粗酶液；將果膠酶粗酶液利用離心機(jī)和超濾膜初步分離純化后，利用DNS法進(jìn)行果膠酶酶活的測(cè)試； 發(fā)酵培養(yǎng)基中的果膠酶底物為:果膠、或柚子粉、或木粉、或麩皮粉、或大麻桿粉。2.權(quán)利要求1所述的用于木材加工的果膠酶，其特征在于該果膠酶的性能參數(shù)為:最適使用溫度為45 °C、最適pH值為4.0-5.5、在溫度4 °C或以下溫度儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)間為24-72h ;在37°C條件下儲(chǔ)存時(shí)，儲(chǔ)存時(shí)間不能超過(guò)48h。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于木材加工的果膠酶，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用保藏編號(hào)CCTCC？M2015032的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（<i>Bacillus？methylotrophicus</i><i>）</i>HS047，通過(guò)種子菌體培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)得到用于木材加工的果膠酶。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、利用完全適應(yīng)植物內(nèi)部環(huán)境的內(nèi)生菌為出發(fā)菌株，制備出在pH值4.5-5.5環(huán)境能夠充分發(fā)揮果膠酶活性的果膠酶溶液，對(duì)于實(shí)現(xiàn)、促進(jìn)木質(zhì)材料的生物加工奠定基礎(chǔ)；2、能高效用于木材加工的果膠酶，對(duì)于實(shí)現(xiàn)生物制漿、綠色纖維分離和生物紡織均具有一定的推動(dòng)和促進(jìn)作用。CCTCC NO:M201503220150111
【IPC分類】C12N9/26, C12N9/88, C12R1/07, C12N9/18
【公開(kāi)號(hào)】CN105018456
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510448403
【發(fā)明人】鄒成鋼, 喬敏, 李曉平, 王齊瑋, 吳寧, 肖瑞
【申請(qǐng)人】云南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月28日