一種添加甜菜堿提高2-酮基-l-古龍酸生產(chǎn)強度的方法
【專利說明】一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法
[0001]本發(fā)明專利申請是分案申請。原案的申請?zhí)柺?01310693045.7，申請日是2013年12月18日，發(fā)明名稱是:一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法。
技術領域
[0002]本發(fā)明屬于發(fā)酵制備維生素C技術領域，更具體地說，涉及一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法。
[0003]
【背景技術】
[0004]維生素C是人體必需的水溶性維生素，參與多種代謝活動。2-酮基-L-古龍酸酸(2-keto-L-gulonic acid，以下簡稱2-KLG)是合成維生素C重要的前體。目前國內(nèi)主要維生素C生產(chǎn)廠家均采用“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)工藝，這一技術的關鍵步驟是其第二步發(fā)酵過程，L-山梨糖在一種混合菌系作用下被生物氧化為2-KLG，該混合菌系由兩種微生物組成，其中起糖酸轉(zhuǎn)化作用的微生物為普通生酮基古龍酸菌，俗稱小菌?；旌暇抵辛硪环N微生物為伴生菌，大多為革蘭氏陽性芽孢桿菌，俗稱大菌，如巨大芽孢桿菌等。在第二步發(fā)酵過程中，常出現(xiàn)生產(chǎn)前期大、小菌比例失調(diào)，大菌旺盛生長，發(fā)酵前期PH異常波動，小菌受到抑制，小菌不適應高濃發(fā)酵等現(xiàn)象，造成發(fā)酵周期長、能耗高等技術問題，因此，改進原有發(fā)酵生產(chǎn)工藝，提高2-KLG生產(chǎn)強度是非常必要的。
[0005]甜菜堿是一種中性物質(zhì)，能夠維持細胞滲透壓，甜菜堿的溶解度很高，不帶凈電荷，其高濃度對許多酶及其他生物大分子沒有影響，甚至有保護作用。目前通過添加甜菜堿來提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度尚未見文獻報道。專利CN200910034773.0公開了一種添加海藻糖強化2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加海藻糖，海藻糖作為滲透保護劑，提高耐高滲透能力；專利CN201010533043.8公開了一種提高2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)強度的方法，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加明膠提高2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)強度；專利CN201210314745.6公開了一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產(chǎn)的方法，是通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加D-核糖母液實現(xiàn)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術中存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種提高2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)強度的方法，能夠有效提高2-酮基-L-古龍酸的轉(zhuǎn)化率，縮短發(fā)酵周期，實現(xiàn)高濃發(fā)酵。
[0007]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下:
一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法，采用普通生酮基古龍酸菌和巨大芽孢桿菌混合菌系為生產(chǎn)菌株，以L-山梨糖為底物發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加
0.05%~1.0%的甜菜堿。
[0008]培養(yǎng)基條件為: 固體培養(yǎng)基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.2，玉米漿0.5，尿素0.2，MgSO4^H 20 0.03，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，瓊脂 2.5，PH6.8-7.2。
[0009]液體種子培養(yǎng)基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.3，玉米漿0.5，尿素0.2，MgSO4.H 200.01，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，瓊脂 2.5，PH6.8-7.2。
[0010]發(fā)酵培養(yǎng)基(％):山梨糖8.0，玉米漿0.5，尿素 HMgSCVH 20 0.02, KH2PO4 0.05,CaCO3 0.5，PH6.8-7.2，其中山梨糖單獨滅菌。
[0011]本發(fā)明采用搖瓶培養(yǎng)方法培養(yǎng)菌種。
[0012]種液培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度28-30°C，培養(yǎng)時間為24小時，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。
[0013]發(fā)酵瓶培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度29-33°C，接種量12%，搖床轉(zhuǎn)速210rpm，培養(yǎng)時間為72小時，發(fā)酵培養(yǎng)基中按實驗要求添加不同濃度的甜菜堿(濃度范圍0.059^1.0%)。
[0014]用碘量法測定發(fā)酵液中的2-酮基-L-古龍酸；用二苯胺法測定發(fā)酵液中殘余的L-山梨糖。
[0015]有益效果:本發(fā)明采用的上述工藝，發(fā)酵前期PH波動小，混合菌比例合適，菌種活力增強，2-酮基-L-古龍酸的生成速率大幅提高，可以有效縮短2-酮基-L-古龍酸的發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)強度。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步進行描述。
[0017]本發(fā)明培養(yǎng)基:
固體培養(yǎng)基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.2，玉米漿0.5，尿素0.2，MgSO4^H 20 0.03，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，瓊脂 2.5，PH6.8-7.2。
[0018]液體種子培養(yǎng)基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.3，玉米漿0.5，尿素0.2，MgSO4.H 200.01，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，瓊脂 2.5，PH6.8-7.2。
[0019]發(fā)酵培養(yǎng)基(％):山梨糖8.0，玉米漿0.5，尿素 U’MgSO^H 20 0.02, KH2PO4 0.05,CaCO3 0.5，ΡΗ6.8-7.2，其中山梨糖單獨滅菌。
[0020]本發(fā)明搖瓶培養(yǎng)
種液培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度28-30°C，培養(yǎng)時間為24小時，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。
[0021]發(fā)酵瓶培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度29-33°C，接種量12%，搖床轉(zhuǎn)速210rpm，培養(yǎng)時間為72小時，發(fā)酵培養(yǎng)基中按實驗要求添加不同濃度的甜菜堿(濃度范圍0.059^1.0%)。
[0022]發(fā)酵液中2-KLG的測定:改進的碘量法；發(fā)酵液中殘余的L-山梨糖測定:二苯胺法。
[0023]實施例1
將培養(yǎng)好的普通生酮基古龍酸菌和巨大芽孢桿菌的混合菌液6ml，接入到40ml含有8%的山梨糖、0.5%玉米漿、1.2%尿素、0.02%硫酸鎂、0.05%磷酸二氫鉀、0.5%碳酸鈣、0.1%甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始PH7.0，培養(yǎng)溫度29 °C，搖瓶容積500ml，搖床轉(zhuǎn)速210rpm，發(fā)酵液終點2-KLG含量79.16mg/ml，發(fā)酵周期60小時，生產(chǎn)強度為1.32g/l *h。試驗組與對照組相比發(fā)酵周期縮短了 9.1%，2-KLG產(chǎn)量和生產(chǎn)強度分別提高了 2.87%和14.2%。
[0024]實施例2
將培養(yǎng)好的普通生酮基古龍酸菌和巨大芽孢菌的混合菌液12ml，接入到80ml含有8%的山梨糖、0.5%玉米漿、1.2%尿素、0.02%硫酸鎂、0.05%磷酸二氫鉀。0.5%碳酸鈣、0.5%甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始PH7.0，培養(yǎng)溫度31°C，搖瓶容積750ml，搖床轉(zhuǎn)速210rpm，發(fā)酵液終點2-KLG含量79.72mg/ml，發(fā)酵周期56小時，生產(chǎn)強度為1.42g/l *h。試驗組與對照組相比發(fā)酵周期縮短了 15.2%，2-KLG產(chǎn)量和生產(chǎn)強度分別提高了 2.96%和16.4%。
[0025]實施例3
將培養(yǎng)好的普通生酮基古龍酸菌和巨大芽孢菌的混合菌液12ml，接入到80ml含有8%的山梨糖、0.5%玉米漿、1.2%尿素、0.02%硫酸鎂、0.05%磷酸二氫鉀。0.5%碳酸鈣、0.2%甜菜堿的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始PH7.0，培養(yǎng)溫度31°C，搖瓶容積750ml，搖床轉(zhuǎn)速210rpm。發(fā)酵12h后，每間隔4h補加0.02%甜菜堿至終點。發(fā)酵液終點2-KLG含量79.95mg/ml，發(fā)酵周期54小時，生產(chǎn)強度為1.48g/l *h試驗組與對照組相比發(fā)酵周期縮短了 18.1%,2-KLG產(chǎn)量和生產(chǎn)強度分別提高了 4.29%和19.1%。
[0026]顯然，本發(fā)明不限于這些公開的實施例，本發(fā)明將覆蓋技術方案所描述的范圍，以及權利要求范圍的各種變形和等效變化，在不偏離本發(fā)明的技術解決方案的前體下，對本發(fā)明所作的本領域技術人員容易實現(xiàn)的任何修改或改進均屬于本發(fā)明所要求保護的范圍。
【主權項】
1.一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法，其特征在于:采用普通生酮基古龍酸菌和巨大芽孢桿菌混合菌系為生產(chǎn)菌株，以L-山梨糖為底物發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.05%~1.0%的甜菜堿，培養(yǎng)基條件為: 固體培養(yǎng)基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.2，玉米漿0.5，尿素0.2，MgS04.H 20 0.03，KH2P04 0.02，CaC03 0.5，瓊脂 2.5，PH6.8-7.2 ； 液體種子培養(yǎng)基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.3，玉米漿0.5，尿素0.2,MgSCM^H 20 0.01，KH2P04 0.02，CaC03 0.5，瓊脂 2.5，PH6.8-7.2 ； 發(fā)酵培養(yǎng)基(％):山梨糖8.0，玉米漿0.5，尿素1.2，1%504.!! 20 0.02，KH2P04 0.05，CaC03 0.5，PH6.8-7.2，其中山梨糖單獨滅菌。2.如權利要求1所述的一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法，其特征在于:采用搖瓶培養(yǎng)方法培養(yǎng)菌種。3.如權利要求1所述的一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法，其特征在于:種液培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度28-30°C，培養(yǎng)時間為24小時，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。4.如權利要求1所述的一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法，其特征在于:發(fā)酵瓶培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度29-33°C，接種量12%，搖床轉(zhuǎn)速210rpm，培養(yǎng)時間為72小時。5.如權利要求1所述的一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法，其特征在于:用碘量法測定發(fā)酵液中的2-酮基-L-古龍酸；用二苯胺法測定發(fā)酵液中殘余的L-山梨糖。
【專利摘要】本發(fā)明闡述了一種添加甜菜堿提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法，屬于發(fā)酵制備維生素C技術領域。采用普通生酮基古龍酸菌和巨大芽孢桿菌混合菌系為生產(chǎn)菌株，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加0.05%~1.0%甜菜堿作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，促進細胞生長和2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的生產(chǎn)，實現(xiàn)2-KLG高效生產(chǎn)。本發(fā)明采用上述工藝，可有效縮短2-酮基-L-古龍酸的發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)強度。
【IPC分類】C12P7/60, C12R1/11, C12P39/00
【公開號】CN104988201
【申請?zhí)枴緾N201510453917
【發(fā)明人】孔太, 胡少斌, 陳紅, 劉杰
【申請人】帝斯曼江山制藥（江蘇）有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2013年12月18日
【公告號】CN103642889A