一種獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術育種技術領域，具體設及一種獲得抗病毒無核葡萄的生 物技術育種方法。
【背景技術】
[0002] 葡萄是世界上最古老的果樹樹種之一，W其味美多汁、營養(yǎng)豐富及具有多種保健 功能深受國內(nèi)外消費者喜愛，近年來，國內(nèi)外市場對鮮食葡萄品種的要求也越來越高，尤其 是無核葡萄越來越受到人們的青睞，現(xiàn)有無核葡萄品種已不能滿足生產(chǎn)上的需求。同時， 葡萄也是感染病毒種類最多的果樹樹種[Martelli等.Grapevinevirologyhi曲li曲ts; 2010 - 2012.Proceedingsof化el7thCongressofICVG，Davis，California，USA， 2012:13-31]。近年來，我國各地競相發(fā)展葡萄，地區(qū)間引種比較頻繁，病毒本身可隨苗木進 行遠距離傳播，導致一些地方病害蔓延。據(jù)調(diào)查[劉曉等.部分葡萄品種的病毒病鑒定及 健康狀況評價.果樹學報，2006, 23 (6) :846-849]，我國多數(shù)主栽品種和化木普遍帶毒，有 些品種的帶毒株率幾乎達到100%。其中，葡萄扇葉病毒佑FLV)、葡萄卷葉病毒佑LRaV，主 要病原是化RaV-3)葡萄病毒A(GVA)和葡萄病毒B(GVB)是生產(chǎn)中最為廣泛存在的4種危 險性病毒，目前，葡萄病毒病已成為我國果樹生產(chǎn)中亟待解決的問題，現(xiàn)有技術水平下全世 界尚無有效的藥劑防治辦法，而培育抗病品種無疑是一條最為經(jīng)濟有效的途徑。
[0003] 現(xiàn)代葡萄育種的理論[Ramming等.Hybridizationofseedlessgrapes. Vitis, 1990(Specialissue) :439-444]認為，采用"無核X無核"葡萄品種間雜交，通 過胚挽救的方法容易獲得無核后代，雜種后代中無核類型比例可達80%W上。目前，該 種生物技術育種方法已成功應用于無核葡萄育種技術領域[田莉莉等.Seedlessgrape breedingfordiseaseresistancebyusingembryorescue.Vitis，2008,47 (1):15-19 ; 田莉莉等.Breedingofdisease-resistantseedlessgrapesusingChinesewild Vitisspp.I.Invitroembryorescueandplantdevelopment.ScientiaHorticultur ae，2008, 117(2) : 136-141]。同時，在植物抗病毒育種方面，利用植物外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化植物 是目前培育抗病品種的主要手段。近年來，RNAi技術的發(fā)展為植物轉(zhuǎn)基因抗病毒提供了新 策略。前人的研究表明，轉(zhuǎn)化病毒外殼蛋白基因的全部或部分片段構建的RNAi載體，均能 獲得抗病的轉(zhuǎn)基因植株[朱常香等.多抗PVY、TMV和CMV轉(zhuǎn)基因煙草的培育.中國農(nóng)業(yè)科 學，2008,41 (4) : 1040-1047]。多數(shù)研究者在構建RNAi載體時，通常選取的是病毒基因組中 相對保守的片段作為干擾片段，該樣還可W減少因病毒變異造成的轉(zhuǎn)基因植株抗病性的喪 失技U等.Conservedsequencesofreplicasgene-mediatedresistancetoPotyvirus t虹ou曲RNAsilencing.JournalofPlantBiology, 2009, 52 (6):550-559]。
[0004] 目前普遍采用的胚挽救技術培育無核葡萄方法尚存在不足之處：由于生產(chǎn)上栽培 的多數(shù)無核葡萄屬于歐亞種，雖然品質(zhì)優(yōu)良但抗病性普遍較差，通過胚挽救該一技術雖然 容易獲得"無核X無核"的無核后代，但獲得的無核葡萄往往比親本更不抗病，更容易受到 自然界中各種病毒的危害，因此，僅僅依靠胚挽救該一單一的生物技術手段獲得的無核葡 萄，在抗病毒病方面存在很大缺陷。
[0005] 采用傳統(tǒng)的葡萄轉(zhuǎn)基因技術培育抗病毒葡萄的缺點；（1)必需利用完整基因翻譯 策略，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品無法排除安全隱患；（2)轉(zhuǎn)化植株的抗病毒反應多數(shù)表現(xiàn)為延遲發(fā)病，屬 于耐病性；（3)如果外源基因片段過大，容易出現(xiàn)目的基因僅部分導入或?qū)牖騼H能部 分表達的現(xiàn)象；(4)轉(zhuǎn)化植株高抗病性的獲得往往需要多拷貝。
[0006] 目前，雖然通過胚挽救的方法可W培育無核葡萄新品種，但由于多數(shù)無核葡萄屬 于歐亞種，普遍存在抗病性差的缺點，而靠胚挽救該一單一的生物技術手段技術獲得的無 核葡萄后代往往比它們的親本更不抗病，更容易受到各種病毒的威脅。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法，在無核葡萄 育種技術領域，將胚挽救技術和轉(zhuǎn)基因兩種生物技術手段進行有機融合，在對無核葡萄雜 種胚進行離體培養(yǎng)的過程中，利用帶有無核基因的合子胚誘導發(fā)生的胚狀體作為轉(zhuǎn)基因受 體材料，設法導入含有病毒外殼蛋白基因的RNAi抗病毒載體，從而獲得既抗病毒病又無核 的葡萄再生植株新材料。
[000引本發(fā)明所采用的技術方案是，一種獲得抗病毒無核葡萄的生物技術育種方法，包 括W下步驟：
[0009] 步驟1、通過無核葡萄品種間雜交和胚挽救獲得帶無核基因的葡萄合子胚；
[0010] 步驟2、通過合子胚誘導發(fā)生葡萄體細胞胚；
[0011] 步驟3、構建RNAi抗病毒植物表達載體并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌；
[0012] 步驟4、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化合子胚來源的體細胞胚獲得再生植株。
[0013] 本發(fā)明的特點還在于：
[0014] 步驟1中通過無核葡萄品種間雜交和胚挽救獲得帶無核基因的葡萄合子胚具體 為：
[0015] 步驟1. 1、開花前3天對母本品種進行人工去雄，去雄后的花序立即用清水噴洗干 凈并套袋、掛牌標記；
[0016] 步驟1. 2、去雄后第2-3天用毛筆薩取父本花粉散落在母本柱頭上進行人工授粉；
[0017] 步驟1. 3、授粉后6周田間采集幼果，自來水沖洗lOmin;在超凈工作臺上用70% 的酒精浸泡1分鐘后，再用0. 1%的化C12浸泡消毒8分鐘，無菌水漂洗4次；
[0018] 步驟1.4、消毒后的果粒置于滅過菌的培養(yǎng)皿中，無菌條件下取出胚珠，接種在合 子胚發(fā)育培養(yǎng)基上進行胚珠內(nèi)胚培養(yǎng)，合子胚發(fā)育培養(yǎng)基為固液雙相的化培養(yǎng)基；
[0019] 步驟1. 5、胚珠在合子胚發(fā)育培養(yǎng)基上培養(yǎng)6周后，無菌條件下取出發(fā)育的幼胚， 接種在固體的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上；即獲得帶無核基因的葡萄合子胚。
[0020] 化培養(yǎng)基的組分和含量如下；硝酸巧250.0 mg/L，硝酸鐘600.0 mg/L，氯化鐘 75. Omg/L，硝酸錠300.0 mg/L，硫酸儀1200.0 mg/L，磯酸二氨鐘300.0 mg/L，硫酸鋪3. Omg/L， 艦化鐘0.8mg/L，棚酸0. 5mg/L，硫酸鋒0. 5mg/L，亞砸酸鋼0. 25mg/L，氯化鉆0. 025mg/L，硫 酸銅0. 025mg/L，鋼酸鋼0. 025mg/L，巧樣酸鐵10.0 mg/l，鹽酸硫胺素0. 25mg/l，鹽酸化唉辛 0. 25mg/L，D-泛酸巧0. 25mg/L，煙酸0. 25mg/L，天冬酷胺300mg/L，甘氨酸5. Omg/L，精氨酸 2. Omg/L，肌醇50.0 mg/L，水解酪蛋白500.0 mg/L，k半脫氨酸121. 16mg/L，庶糖30000mg/ L，瓊脂6000mg/l，其余為蒸饋水，其中附加庶糖6.Og/l，活性炭1. 5g/L;步驟1. 5中誘導培 養(yǎng)基為他性愈傷組織誘導培養(yǎng)基的成分為化+0. 5mg/L6-BA+l.Omg/L2,4-D，其中附加庶 糖 30g/l，瓊脂 6.0g/L。
[0021] 步驟2中通過合子胚誘導發(fā)生體細胞胚具體為：
[0022] 步驟2. 1、將步驟1獲得的雜交合子胚接種在固體的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上；
[0023] 步驟2. 2、合子胚在胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，將獲得的黃色、顆粒 狀、發(fā)育緊實的胚性愈傷組織接種在固體的體細胞胚分化培養(yǎng)基上；
[0024] 步驟2. 3、胚性愈傷組織在體細胞胚分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，即可誘導獲得大量 的體細胞胚，此時多數(shù)體細胞胚發(fā)育時期處在子葉型期。
[0025] 步驟2. 1中胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基的成分為化+0. 5mg/L6-BA+l.Omg/L2， 4-D，其中附加庶糖30g/l，瓊脂6.Og/L;所述步驟2. 3中體細胞胚分化培養(yǎng)基的成分為TL+0. 5mg/L6-BA+2.Omg/LNAA，其中，附加庶糖 30g/l，瓊脂 6.Og/L。
[0026] 步驟3中構建RNAi抗病毒植物表達載體并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌具體為：
[0027] 步驟3. 1、構建入口克隆載體；RNAi干擾片段GV是GFLV、化RaV-3、GVA和GVB4 個葡萄病毒外殼蛋白基因的保守區(qū)段順序串聯(lián)后獲得的82化P的大片段，序列見SEQID NO. 1 ;用添加接頭CACC的GV上游引物GV-F和下游引物GV-R進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后目標條帶切膠回收，獲得含干擾片段GV的平末端PCR產(chǎn)物；構建 6yL連接反應體系，25°C條件下反應30min，連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細 胞，均勻涂布在含75mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C倒置培養(yǎng)16h，挑單克隆到 含有相同濃度Kan的LB液體培養(yǎng)基中37°C震蕩培養(yǎng)1化，擴增片段的長度明顯大于插入片 段GV的長度，即構建好入口克隆載體；命名為祀NTR-GV;
[0028] 步驟3. 2、構建RNAi載體；將入口載體祀NTR-GV和目標載體P肥化SGATE12進行LR 反應，