一種微擬球藻高密度培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微擬球藻高密度培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蝦青素具有良好的著色功能和超強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力等許多重要的生理和生物學(xué)功能，具有清除氧自由基的強(qiáng)大能力，其抗氧化活性是維生素E的550倍、類胡蘿卜素的10倍，被譽(yù)為“超級(jí)抗氧化劑”。蝦青素具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，對人體絕對安全，目前主要作為人類的高級(jí)保健食品、藥品、化妝品，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物和家禽、家畜的飼料添加劑，市場前景非常廣闊。
[0003]目前，蝦青素的生產(chǎn)工藝主要有化學(xué)合成和生物提取兩種?；瘜W(xué)合成的蝦青素在結(jié)構(gòu)、功能及安全性等方面都不及天然的蝦青素，動(dòng)物和人體試驗(yàn)結(jié)果表明，天然蝦青素沒有任何致病效應(yīng)或毒副作用，對人體安全無害。微擬球藻細(xì)胞內(nèi)天然蝦青素的含量相對較高，在特定條件下，微擬球藻可以積累占其干重I %以上的蝦青素，且所含蝦青素的結(jié)構(gòu)與養(yǎng)殖對象所需一致，被公認(rèn)為天然蝦青素的最好生物來源，通過培養(yǎng)微擬球藻來提取蝦青素具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種微擬球藻高密度培養(yǎng)方法，通過在光生物反應(yīng)器內(nèi)制備培養(yǎng)基，嚴(yán)格控制接種溫度和光照培養(yǎng)等條件，使得微擬球藻生長速率提高，繁殖速度加快，提高了培養(yǎng)效率。
[0005]其技術(shù)解決方案包括:
[0006]一種微擬球藻高密度培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0007]a、接種步驟，在封閉的光生物反應(yīng)器內(nèi)配制培養(yǎng)基，然后將生長至指數(shù)生長期的微擬球藻藻種接種到所述培養(yǎng)基中，所述微擬球藻藻種的接種量為5-15% ；
[0008]b、培養(yǎng)步驟，采用人工LED光源培養(yǎng)，該培養(yǎng)步驟依次分為兩個(gè)階段，第一階段內(nèi)培養(yǎng)溫度為22-25°C，采用單色光白光照射3-5天，白光光照強(qiáng)度為500?20001x ;第二階段內(nèi)培養(yǎng)溫度為22-25?，采用白光和紅光共同照射6-11天，控制光照強(qiáng)度為1000?30001x，通氣比0.2?1: lv/vm, 二氧化碳含量占0.05?I %。
[0009]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，步驟a中，每升培養(yǎng)基中含有NaAc 0.5?3g, KNO30.3 ?0.6g，KH2PO40.02 ?0.lg, MgSO40.05 ?0.2g，CaCl20.03 ?0.lg, Fe-EDTA 母液1ml，微量元素母液Iml和維生素母液1ml，所述培養(yǎng)基的pH值為7?8。
[0010]作為本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案，步驟b中，采用白光照射4天，采用白光和紅光共同照射8天。
[0011]優(yōu)選的，每升Fe-EDTA母液中含有0.1?0.5g的EDTA和0.1?0.5g的FeSO4。
[0012]優(yōu)選的，每升微量元素母液中含有5?15mg的H3BO3、5?13mg的MnSO4、5?12mg的 ZnSO4、2 ?8mg 的 CuSO4、0.1 ?Img 的 Na2MoO4和 0.1 ?0.8mg 的 CoCl 2。
[0013]優(yōu)選的，每升維生素母液中含有0.2?Ig的維生素BI和0.025?0.05g的維生素 B12。
[0014]本發(fā)明所帶來的有益技術(shù)效果:
[0015](I)培養(yǎng)基在封閉的光生物反應(yīng)器內(nèi)配制，有效阻止了空氣中雜質(zhì)和細(xì)菌的進(jìn)入，并且光生物反應(yīng)器可以更好的控制溫度，保證了微擬球藻藻細(xì)胞的接種始終在適宜的溫度內(nèi)。
[0016](2)本發(fā)明采用人工LED光源進(jìn)行光照，首先采用白光光照3-5天，再用白光和紅光共同照射6-11天，由于微擬球藻的繁殖適宜在弱光下進(jìn)行，用現(xiàn)有技術(shù)中的太陽光一方面溫度不好控制，另一方面在不同的季節(jié)溫度達(dá)不到微擬球藻繁殖的適宜溫度，通過人工LED光源照射，較好的控制了微擬球藻繁殖所需的溫度，另外，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比較，本培養(yǎng)方法還節(jié)省了控溫的能耗，由于溫度易控制，因此培養(yǎng)周期也相應(yīng)縮短了，經(jīng)過實(shí)施例的分析檢測，合理控制白光以及白光和紅光的混合光照時(shí)間，培養(yǎng)得到的微擬球藻細(xì)胞濃度可達(dá)30.4萬/mL，明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到的微擬球藻細(xì)胞濃度(120萬/mL以下)。
[0017](3)本發(fā)明培養(yǎng)基的配方中，NaAc、Fe-EDTA母液、KN03、MgSO4、CaCl2等有效抑制了微擬球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累，有利于微擬球藻細(xì)胞的分裂，為后期蝦青素的累積總量的增加奠定物質(zhì)基礎(chǔ)；該培養(yǎng)基適宜微擬球藻的快速生長，藻液濃度高。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0019]實(shí)施例1:
[0020]本發(fā)明的培養(yǎng)方法如下:
[0021]步驟1、在封閉光生物反應(yīng)器中配制培養(yǎng)基，將培養(yǎng)至指數(shù)生長期的藻種(濃度約為8萬/ml)接種到培養(yǎng)基中，接種量5%，反應(yīng)器中培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中含有:NaAc 3g, KNO30.6g，KH2PO40.08g，MgSO40.15g，CaCl20.lg，F(xiàn)e-EDTA 母液 1ml，微量元素母液lml，維生素母液1ml，控制pH為8 ；EDTA-Fe母液配方為每升含有:EDTA 0.5g，F(xiàn)eSO40.4g ；微量元素母液配方為每升含有:H3B0310mg，MnS048mg，ZnS048mg，CuSO44mg, Na2MoO40.6mg，CoCl20.5mg;維生素母液配方為每升含有:維生素BI 0.2g，維生素B12 0.025g ；
[0022]步驟2、第一階段的培養(yǎng)，控制溫度22°C;光照時(shí)間每天12h，開始3天用白光光照，光照強(qiáng)度100Ix ;
[0023]步驟3、第二階段的培養(yǎng)，第一階段完成后，控制溫度不變，改用白光加紅光進(jìn)行光照，光照6天，光照強(qiáng)度20001x ;通氣比1:lv/vm，二氧化碳含量占0.05%，得到高密度微擬球藻培養(yǎng)物。
[0024]經(jīng)生化檢測，本實(shí)施例制備得到的微擬球藻細(xì)胞濃度為23.6萬/ml。
[0025]實(shí)施例2:
[0026]本發(fā)明微擬球藻的培養(yǎng)方法，具體包括:
[0027]步驟1、在封閉光生物反應(yīng)器中配制培養(yǎng)基，將培養(yǎng)至指數(shù)生長期的藻種(濃度約為8萬/ml)接種到培養(yǎng)基中，接種量10%，反應(yīng)器中培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中含有:NaAc 1.5g, KNO30.5g，KH2PO40.06g，MgSO40.lg，CaCl20.06g，F(xiàn)e-EDTA母液 1ml，微量元素母液lml，，維生素母液1ml，控制pH為8 ；EDTA-Fe母液配方為每升含有:EDTA 0.3g, FeSO40.2g ；微量元素母液配方為每升含有:H3B038mg，MnS048mg，ZnSO41mg, CuS045mg，Na2MoO40.6mg，CoCl20.4mg ;維生素母液配方為每升含有:維生素BI 0.5g，維生素B12 0.04g ；
[0028]步驟2、第一階段的培養(yǎng)，控制溫度22°C;光照時(shí)間每天12h，開始4天用白光光照，光照強(qiáng)度100Ix ;
[0029]步驟3、第二階段的培養(yǎng)，第一階段完成后，控制溫度不變，改用白光加紅光進(jìn)行光照，光照8天，光照強(qiáng)度20001x ;通氣比1:lv/vm，二氧化碳含量占0.05%，得到高密度微擬球藻培養(yǎng)物。
[0030]經(jīng)生化檢測，本實(shí)施例制備得到的微擬球藻細(xì)胞濃度為30.4萬/ml。
[0031]實(shí)施例3:
[0032]本發(fā)明微擬球藻的培養(yǎng)方法，具體包括:
[0033]步驟1、在封閉光生物反應(yīng)器中配制培養(yǎng)基，將培養(yǎng)至指數(shù)生長期的藻種(濃度約為8萬/ml)接種到培養(yǎng)基中，接種量10%，反應(yīng)器中培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中含有:NaAc 3g, KNO30.6g，KH2PO40.08g，MgSO40.15g，CaCl20.lg, Fe-EDTA 母液 1ml，微量元素母液lml，維生素母液1ml，控制pH為8 ；EDTA-Fe母液配方為每升含有:EDTA 0.5g，F(xiàn)eSO40.4g ；微量元素母液配方為每升含有:H3B0310mg，MnS048mg，ZnS048mg，CuSO44mg, Na2MoO40.6mg，CoCl20.5mg;維生素母液配方為每升含有:維生素BI 0.2g，維生素B12 0.025g ；
[0034]步驟2、第一階段的培養(yǎng)，控制溫度22°C;光照時(shí)間每天12h，開始5天用白光光照，光照強(qiáng)度100Ix ;
[0035]步驟3、第二階段的培養(yǎng)，第一階段完成后，控制溫度不變，改用白光加紅光進(jìn)行光照，光照9天，光照強(qiáng)度20001x ;通氣比1:lv/vm，二氧化碳含量占0.05%，得到高密度微擬球藻培養(yǎng)物。
[0036]經(jīng)生化檢測，本實(shí)施例制備得到的微擬球藻細(xì)胞濃度為28.4萬/ml。
[0037]對比例1:
[0038]對比例I與實(shí)施例1不同之處在于，步驟I中在開放式的反應(yīng)器內(nèi)配制培養(yǎng)基，其加熱方式為普通光照來控制。
[0039]經(jīng)生化檢測，對比例I制備得到的微擬球藻細(xì)胞濃度為14.3萬/ml。
[0040]本
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限于實(shí)施例所述內(nèi)容，實(shí)施例僅為實(shí)驗(yàn)過程具體操作舉例，所舉實(shí)例外的其他數(shù)據(jù)均在本發(fā)明權(quán)利范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種微擬球藻高密度培養(yǎng)方法，其特征在于:包括以下步驟: a、接種步驟，在封閉的光生物反應(yīng)器內(nèi)配制培養(yǎng)基，然后將生長至指數(shù)生長期的微擬球藻藻種接種到所述培養(yǎng)基中，所述微擬球藻藻種的接種量為5-15% ； b、培養(yǎng)步驟，采用人工LED光源培養(yǎng)，該培養(yǎng)步驟依次分為兩個(gè)階段，第一階段內(nèi)培養(yǎng)溫度為22-25°C，采用單色光白光照射3-5天，白光光照強(qiáng)度為500?20001x ;第二階段內(nèi)培養(yǎng)溫度為22-25°C，采用白光和紅光共同照射6-11天，控制光照強(qiáng)度為1000?30001x，通氣比0.2?1:lv/vm，二氧化碳含量占0.05?1%，即得微擬球藻。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微擬球藻高密度培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟a中，每升培養(yǎng)基中含有 NaAc 0.5 ?3g、KN03 0.3 ?0.6g,KH2PO4 0.02 ?0.lg、MgS04 0.05 ?0.2g,CaCl20.03?0.lg,Fe-EDTA母液1ml、微量元素母液Iml和維生素母液1ml，所述培養(yǎng)基的pH值為7?8。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微擬球藻高密度培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟b中，采用白光照射4天，采用白光和紅光共同照射8天。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微擬球藻高密度培養(yǎng)方法，其特征在于:每升Fe-EDTA母液中含有0.1?0.5g的EDTA和0.1?0.5g的FeSO4。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微擬球藻高密度培養(yǎng)方法，其特征在于:每升微量元素母液中含有 5 ?15mg 的 H3BO3>5 ?13mg 的 MnSO4>5 ?12mg 的 ZnSO4>2 ?8mg 的 CuS04、0.1 ?Img 的 Na2MoO4和 0.1 ?0.8mg 的 CoCl 2。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微擬球藻高密度培養(yǎng)方法，其特征在于:每升維生素母液中含有0.2?Ig的維生素BI和0.025?0.05g的維生素B12。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微擬球藻高密度培養(yǎng)方法，其首先在封閉的光生物反應(yīng)器內(nèi)配制培養(yǎng)基，然后將生長至指數(shù)生長期的微擬球藻藻種接種到培養(yǎng)基中；采用人工LED光源培養(yǎng)，分為兩個(gè)階段進(jìn)行培養(yǎng)，第一階段內(nèi)培養(yǎng)溫度為22-25℃，采用單色光白光照射3-5天，白光光照強(qiáng)度為500～2000lx；第二階段內(nèi)培養(yǎng)溫度為22-25℃，采用白光和紅光共同照射6-11天，控制光照強(qiáng)度為1000～3000lx，通氣比0.2～1：1v/vm，二氧化碳含量占0.05～1％。由于微擬球藻的繁殖適宜在弱光下進(jìn)行，本發(fā)明通過人工LED光源照射，較好的控制了微擬球藻繁殖所需的溫度，另外，本發(fā)明還節(jié)省了控溫的能耗，經(jīng)分析檢測，合理控制白光以及白光和紅光的混合光照時(shí)間，培養(yǎng)得到的微擬球藻細(xì)胞濃度可達(dá)30.4萬/mL。
【IPC分類】C12N1/12, C12R1/89
【公開號(hào)】CN104988066
【申請?zhí)枴緾N201510395733
【發(fā)明人】李悅明, 徐建春, 曲文強(qiáng), 李霞, 王道會(huì)
【申請人】青島科海生物有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月8日