專利名稱：微擬球藻培養(yǎng)基配方及三級培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋微藻養(yǎng)埴領(lǐng)域，尤其涉及一種微擬球藻培養(yǎng)基配方及三級培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
微擬球藻(Nannochloropsis oculata)又稱微綠球藻，是一種廣泛分布的海水藻類，直徑為2-4微米，細胞球形，淡緑色，富含不飽和脂肪酸及其它營養(yǎng)元素，其中EPA含量
占脂肪酸總量的30%。EPA能降低膽固醇和甘油三酯的含量，促進體內(nèi)飽和脂肪酸代謝，從而降低血液粘稠度，增進血液循環(huán)，提高組織供氧而消除疲勞，并防止脂肪在血管壁的沉積，預(yù)防動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展、預(yù)防腦血栓、腦溢血、高血壓等心腦血管疾病。EPA在減輕炎癥方面也起著重要的作用。另外，微擬球藻油脂含量占干重的68%以上，是提煉生物柴油的理想微藻。目前，微擬球藻規(guī)?；囵B(yǎng)存在的主要問題是生長緩慢，生物量低，易污染，特別是梅雨季節(jié)，不利于大規(guī)模培養(yǎng)。以前使用的微擬球藻培養(yǎng)基沒有加入碳酸氫鈉，但我的實驗表明，微擬球藻除了能利用空氣中游離的C02，還能有效地利用培養(yǎng)液中的HC03-作為碳源。大量實驗表明添加O. 5g/L的碳酸氫鈉能能很好地促進微擬球藻的生長。另外，我還在培養(yǎng)基中補充了檸檬酸鐵、維生素H、赤霉素和人尿，能將產(chǎn)量提高54%?？傊?，使用優(yōu)化培養(yǎng)基并采用三級培養(yǎng)微擬球藻方法具有生長速度快、產(chǎn)量高、成本低、不易污染的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種微擬球藻配方及三級培養(yǎng)方法，具體技術(shù)方案如下一種微擬球藻培養(yǎng)基，配方如下=NaNO3 7. 5 X 10_2g，KH2PO4 I X 10_2g，NaHCO35父10、，檸檬酸鐵(卩6(6!1507.5!120)2\10-\，￥812 5 X KTgJB1 I X IO^4g, VH 5Xl(T7g，九ニO植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，人尿2mL，消毒海水lOOOmL。優(yōu)選地,還包括微量元素O. 55 2. 25ml/L,所述微量元素配方為磷酸ニ氫鈉32 40g/L、硫酸銅I. 2 3. 2g/L、硫酸鋅4. 2 6. 2g/L、氯化鈷4 6g/L、氯化錳30 45g/L加水定容至1し優(yōu)選地，所述微量元素溶液中加入120 140g/L的磷酸ニ氫鈉溶液。優(yōu)選地，所述微量元素溶液中加入こニ胺四こ酸ニ鈉3 10g/L。應(yīng)用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基對微擬球藻進行三級培養(yǎng)，包括如下步驟1) ー級培養(yǎng)容器為5000mL三角燒瓶，燒瓶用洗液洗滌、晾干、120°C恒溫消毒；培養(yǎng)用的海水比重1.015 I. 018，鹽度30 32，經(jīng)過經(jīng)脫脂棉過濾、煮沸、冷卻后加入營養(yǎng)鹽；室內(nèi)培養(yǎng)，室溫20-26°C，室內(nèi)自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L: 10D，指數(shù)增長期藻種接種，接種密度300-350 X 104cell/mL,不充氣。培養(yǎng)期間每天搖瓶6次。密度達3000X 104cell/mL，即可轉(zhuǎn)入ニ級培養(yǎng)。2) ニ級培養(yǎng)容器為50L白塑料桶，白塑料桶刷干凈、漂白粉消毒后用消毒水沖干凈備用。ニ級培養(yǎng)用的海水經(jīng)漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理后加入營養(yǎng)鹽；將ー級培養(yǎng)的藻液按I : 10的比例接種到白桶。室內(nèi)培養(yǎng)，室溫20-26 °C，室內(nèi)自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L:10D，充氣培養(yǎng)，充氣量以能將藻細胞沖起懸浮即可。3)三級培養(yǎng)容器為水泥池。面積20-30m2，池深50cm，水深20_30cm，內(nèi)貼白色瓷磚，三級培養(yǎng)用海水經(jīng)漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理。將ニ級培養(yǎng)的藻液作藻種轉(zhuǎn)入水泥池培養(yǎng)，室外培養(yǎng)，自然光照射，充氣，接種密度200-300 X 104cell/mL,培養(yǎng)至密度達 2000-3000 X 104cell/mL 即可收獲。優(yōu)選地，包括在步驟2)中充氣培養(yǎng)時同時施加臭氧。優(yōu)選地，臭氧的濃度為O. 5微克/升空氣 O. 8微克/升空氣。有益效果實驗結(jié)果表明，使用優(yōu)化培養(yǎng)基并采用三級培養(yǎng)微擬球藻具有生長速度快、產(chǎn)量高、成本低、易于操作、不易污染的優(yōu)點。
具體實施例方式培養(yǎng)基配制方法I檸檬酸鐵較難溶解，可加少量自來水在火爐上微熱至80-90°C，并不斷攪拌至全部融化；2赤霉素為白色結(jié)晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每g用50mL酒精或60度白酒溶解I小時以上)，再按所需濃度兌水稀釋。3加營養(yǎng)鹽的過程中需不斷攪水，而且各種營養(yǎng)鹽按配方中提供的順序加入，以免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；4各種營養(yǎng)鹽可先配成濃度較高的母液，再依次添加；5三級培養(yǎng)各階段營養(yǎng)鹽配方和濃度相同。 一種微擬球藻培養(yǎng)基，其特征在于該微擬球藻培養(yǎng)基配方如下NaN037. 5 X10_2g, KH2PO4 lXl(T2g，NaHCO3 5X10、，檸檬酸鐵(FeC6H5O7. 5H20) 2 X l(T4g，VB12SXlO-Tg7VB1 lX10_4g，VH 5 X 10_7g，九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，人尿2mL，消毒海水lOOOmL。優(yōu)選地,還包括微量元素O. 55 2. 25ml/L,所述微量元素配方為磷酸ニ氫鈉32 40g/L、硫酸銅I. 2 3. 2g/L、硫酸鋅4. 2 6. 2g/L、氯化鈷4 6g/L、氯化錳30 45g/L加水定容至1し優(yōu)選地，所述微量元素溶液中加入120 140g/L的磷酸ニ氫鈉溶液。優(yōu)選地，所述微量元素溶液中加入こニ胺四こ酸ニ鈉3 10g/L。微擬球藻三級培養(yǎng)方法I 一級培養(yǎng)一級培養(yǎng)容器為5000mL三角燒瓶，燒瓶用洗液洗滌、晾干、120°C恒溫消毒；培養(yǎng)用的海水比重I. 015，鹽度30，經(jīng)過經(jīng)脫脂棉過濾、煮沸、冷卻后加入營養(yǎng)鹽；室內(nèi)培養(yǎng)，室溫20-26 °C，室內(nèi)自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L: 10D，指數(shù)增長期藻種接種，接種密度300-3 50 X 104cell/mL,不充氣。培養(yǎng)期間每天搖瓶6次。密度達3000X 104cell/mL，即可轉(zhuǎn)入ニ級培養(yǎng)。2 ニ級培養(yǎng)ニ級培養(yǎng)容器為50L白塑料桶，白塑料桶刷干凈、漂白粉消毒后用消毒水沖干凈備用。ニ級培養(yǎng)用的海水經(jīng)漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理后加入營養(yǎng)鹽；將ー級培養(yǎng)的藻液按I : 10的比例接種到白桶。室內(nèi)培養(yǎng)，室溫20-26°C，室內(nèi)自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L: 10D,充氣培養(yǎng)，充氣量以能將藻細胞沖起懸浮即可。3三級培養(yǎng)三級培養(yǎng)容器為水泥池。面積20-30m2，池深50cm，水深20_30cm，內(nèi)貼白色瓷
磚，三級培養(yǎng)用水經(jīng)漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理。將ニ級培養(yǎng)的藻液作藻種轉(zhuǎn)入水泥池培養(yǎng)，室外培養(yǎng)，自然光照射，充氣，接種密度200-300 X IO4ceI Ι/mL，培養(yǎng)至密度達2000-3000 X IO4Cel 1/mL 即可收獲。優(yōu)選地，包括在步驟2)中充氣培養(yǎng)時同時施加臭氧。優(yōu)選地，臭氧的濃度為O. 5微克/升空氣 O. 8微克/升空氣。上述所有的區(qū)間都可以實現(xiàn)，不止端點和中點能實現(xiàn)，在此特別說明。最后應(yīng)說明的是以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解其依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實施例技術(shù)方案的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種微擬球藻培養(yǎng)基，其特征在于該微擬球藻培養(yǎng)基配方如下NaN03 7 . 5Xl(T2g,KH2PO4 I X l(T2g，NaHCO3 5X KT1g,檸檬酸鐵(FeC6H5O7. 5H20) 2X l(T4g，VB12 5 X10_7g, VB1I X 10_4g，VH 5X 10_7g，九二 0植物生長刺激素(赤霉素)5國際單位，人尿2mL，消毒海水IOOOmL0
2.如權(quán)利要求I所述的微擬球藻培養(yǎng)基，其特征在于還包括微量兀素O.55 2. 25ml/L，所述微量元素配方為磷酸二氫鈉32 40g/L、硫酸銅I. 2 3. 2g/L、硫酸鋅4. 2 6.2g/L、氯化鈷4 6g/L、氯化錳30 45g/L加水定容至1L。
3.如權(quán)利要求2所述的微擬球藻培養(yǎng)基，其特征在于所述微量元素溶液中加入120 140g/L的磷酸二氫鈉溶液。
4.如權(quán)利要求2所述的微擬球藻培養(yǎng)基，其特征在于所述微量元素溶液中加入乙二胺四乙酸二鈉3 10g/L。
5.如權(quán)利要求I所述的微擬球藻培養(yǎng)基的三級培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟 1)一級培養(yǎng)容器為5000mL三角燒瓶,燒瓶用洗液洗漆、晾干、120°C恒溫消毒；培養(yǎng)用的海水比重I. 015 I. 018，鹽度30 32，經(jīng)過經(jīng)脫脂棉過濾、煮沸、冷卻后加入營養(yǎng)鹽；室內(nèi)培養(yǎng)，室溫20-26°C，室內(nèi)自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L:10D，指數(shù)增長期藻種接種，接種密度300-350X 104Cell/mL，不充氣。培養(yǎng)期間每天搖動6次，密度達3000X 104cell/mL，即轉(zhuǎn)入二級培養(yǎng)。
2)二級培養(yǎng)容器為50L白塑料桶，白塑料桶刷干凈、漂白粉消毒后用消毒水沖干凈備用。二級培養(yǎng)用的海水經(jīng)漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理后加入營養(yǎng)鹽；將一級培養(yǎng)的藻液按I 10的比例接種到白桶。室內(nèi)培養(yǎng)，室溫20-26°C，室內(nèi)自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L:10D，充氣培養(yǎng)，充氣量以能將藻細胞沖起懸浮即可。
3)三級培養(yǎng)容器為水泥池。面積20-30m2，池深50cm，水深20_30cm，內(nèi)貼白色瓷磚，三級培養(yǎng)用水經(jīng)漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理。將二級培養(yǎng)的藻液作藻種轉(zhuǎn)入水泥池培養(yǎng)，室外培養(yǎng)，自然光照射，充氣，接種密度200-300X IO4ceIΙ/mL，培養(yǎng)至密度達2000-3000 X IO4Cel 1/mL 即可收獲。
6.如權(quán)利要求5所述的微擬球藻培養(yǎng)基的三級培養(yǎng)方法，其特征在于包括在步驟2)中充氣培養(yǎng)時同時施加臭氧。
7.如權(quán)利要求5-6所述的微擬球藻培養(yǎng)基的三級培養(yǎng)方法,其特征在于臭氧的濃度為O.5微克/升空氣 O. 8微克/升空氣。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微擬球藻培養(yǎng)基配方及三級培養(yǎng)方法，配方如下NaNO3 7.5×10-2g，KH2PO4 1×10-2g，NaHCO3 5×10-1g，檸檬酸鐵(FeC6H5O7.5H2O)2×10-4g，VB12 5×10-7g，VB1 1×10-4g，VH 5×10-7g，九二0植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，人尿2mL，消毒海水1000mL。實驗結(jié)果表明，使用優(yōu)化培養(yǎng)基并采用三級培養(yǎng)微擬球藻具有生長速度快、產(chǎn)量高、成本低、易于操作、不易污染的優(yōu)點。
文檔編號C12R1/89GK102851211SQ20121029890
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者王培磊 申請人:王培磊