一種蔬菜細(xì)菌性軟腐病防治藥劑篩選方法
【專利說明】一種蔬菜細(xì)菌性軟腐病防治藥劑篩選方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)藥篩選技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種蔬菜細(xì)菌性軟腐病防 治藥劑篩選方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 蔬菜細(xì)菌性軟腐病是主要由軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum(Jones)Haubenetal)引起的一種世界性流行病害。其 宿主范圍十分廣泛，可以引起多種園藝作物例如胡蘿卜、白菜、芹菜、萵苣、馬鈴薯、甜瓜等 發(fā)生軟腐病并帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于市場(chǎng)上缺乏針對(duì)細(xì)菌性軟腐病的專一性殺菌劑， 目前該病害的防治以預(yù)防為主。然而為了有效控制蔬菜細(xì)菌性軟腐病病害的發(fā)生，開發(fā)及 篩選適宜的防治藥劑是非常必要的。
[0003] 隨著環(huán)境監(jiān)管力度及農(nóng)藥市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)壓力的加大，新型農(nóng)藥的開發(fā)變得更加困難。 目前新型農(nóng)藥的成功篩選率僅為0.0001%。針對(duì)不同致病菌開發(fā)相應(yīng)的高效篩選技術(shù)以 提高新型農(nóng)藥的成功篩選率具有實(shí)際的研宄價(jià)值。我國(guó)在I960年開始使用農(nóng)藥篩選生物 測(cè)定技術(shù)。目前常規(guī)的殺菌劑生物測(cè)定方法根據(jù)測(cè)定原理可分為兩個(gè)主要類型：離體法和 活體法。其中活體法又可細(xì)分為活體植株法及活體組織法。離體法快速、簡(jiǎn)便，但與田間實(shí) 際結(jié)果差異性大。活體植株法雖與田間實(shí)際結(jié)果差異性小，但步驟繁瑣，周期較長(zhǎng)。組織篩 選法是一種介于離體和活體植株之間的篩選方法，其利用植物部分組織或器官作為實(shí)驗(yàn)材 料評(píng)價(jià)殺菌劑的殺菌活性。該類方法不但操作簡(jiǎn)便、快速且與田間實(shí)際結(jié)果有較高的相關(guān) 性，是目前篩選方法中的發(fā)展趨勢(shì)。根據(jù)細(xì)菌性軟腐病病原菌的寄主范圍，開發(fā)一種快速、 簡(jiǎn)單、方便的殺菌劑篩選方法對(duì)篩選適宜的防治藥劑及有效控制蔬菜細(xì)菌性軟腐病病害發(fā) 生具有極大的意義。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004] [要解決的技術(shù)問題]
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種蔬菜細(xì)菌性軟腐病防治藥劑篩選方法。
[0006][技術(shù)方案]
[0007] 本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0008] 本發(fā)明涉及一種蔬菜細(xì)菌性軟腐病防治藥劑篩選方法。
[0009] 該蔬菜細(xì)菌性軟腐病防治藥劑篩選方法的步驟如下：
[0010] A、芹菜組織處理
[0011] 選取定植后生長(zhǎng)70~75天的健康芹菜次外層莖桿組織，將所述莖桿組織兩端切 除，余下中間莖桿組織切成長(zhǎng)度為4~6cm的芹菜莖桿組織段；
[0012] B、接種處理
[0013] 將步驟A得到的芹菜莖桿組織段豎直碼放在盛有濃度為1-5X108cfU/ml胡蘿卜 軟腐果膠桿胡蘿卜亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株（Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)菌 懸液的保濕盒內(nèi)，讓0. 5~1.Ocm芹菜莖桿組織段浸泡在所述菌懸液中；然后取出，再以水 平方式均勻碼放在濾紙上，在室溫下自然風(fēng)干，得到一種接種病原菌的芹菜莖桿組織段；
[0014] C、藥劑處理
[0015] 以與步驟B相同的處理方式，將步驟B得到的接種病原菌芹菜莖桿組織段浸泡在 待篩選蔬菜細(xì)菌性軟腐病防治藥劑水溶液中，接著直接放入保濕盒內(nèi)以水平方式碼放整 齊，在溫度26-30°C與相對(duì)濕度70-85%的條件下保濕培養(yǎng)；在所述芹菜莖桿組織段接種所 述病原菌36h后，根據(jù)下述芹菜莖桿組織段軟腐病病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查芹菜莖桿組織段 的病情指數(shù)：以芹菜莖桿組織段總長(zhǎng)度計(jì)，
[0016] 0級(jí)：芹菜莖桿組織段無任何變化；
[0017] 1級(jí)：發(fā)病芹菜莖桿組織長(zhǎng)度達(dá)到10 %及以下；
[0018] 2級(jí)：發(fā)病芹菜莖桿組織長(zhǎng)度達(dá)到11% -30% ;
[0019] 3級(jí)：發(fā)病芹菜莖桿組織長(zhǎng)度達(dá)到31% -50% ;
[0020] 4級(jí)：發(fā)病芹菜莖桿組織長(zhǎng)度達(dá)到51% -100% ;
[0021] 由所得到的病情指數(shù)按照下述公式計(jì)算防治效果：
[0022] 病情指數(shù)=[E(各級(jí)病莖數(shù)X相對(duì)級(jí)數(shù)代表值）八總莖段數(shù)乂最高級(jí)數(shù)代表 值）]X100% ;
[0023] 防治效果=[(清水對(duì)照平均病情指數(shù)-藥劑處理平均病情指數(shù)）/清水對(duì)照平均 病情指數(shù)]X100% ;
[0024] 當(dāng)防治效果值達(dá)到65%以上時(shí)，這種藥劑可以用于防治蔬菜細(xì)菌性軟腐病。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的芹菜是市場(chǎng)上常見的西芹類與本芹類 斤采品種。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的菌懸液制備步驟如下：將胡蘿卜軟 腐果膠桿胡蘿卜亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株在含有l(wèi)〇g/L蛋白胨、3g/L牛肉粉與5g/L氯化鈉的NB液 體培養(yǎng)基中在溫度26-30°C與轉(zhuǎn)速120-130rpm的條件下振蕩培養(yǎng)22-26h，得到濃度為 l_5X108cfu/ml的菌懸液。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述芹菜莖桿組織段在所述的菌懸液中浸泡 18_22min〇
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，已在所述菌懸液中浸泡的芹菜莖桿組織段在 室溫下自然風(fēng)干〇. 8-1. 2h。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，接種病原菌芹菜莖桿組織段在待篩選蔬菜細(xì) 菌性軟腐病防治藥劑水溶液中浸泡〇. 8-1. 2h。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的蔬菜細(xì)菌性軟腐病是芹菜、生菜、大白 菜、番茄或黃瓜細(xì)菌性軟腐病。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，待篩選蔬菜細(xì)菌性軟腐病防治藥劑是生防菌 類藥劑與化學(xué)成分類藥劑。
[0032] 下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0033] 本發(fā)明涉及一種蔬菜細(xì)菌性軟腐病防治藥劑篩選方法。
[0034] 該蔬菜細(xì)菌性軟腐病防治藥劑篩選方法的步驟如下：
[0035]A、芹菜組織處理
[0036] 選取定植后生長(zhǎng)70~75天的健康芹菜次外層莖桿組織，將所述莖桿組織兩端切 除，余下中間莖桿組織切成長(zhǎng)度為4~6cm的芹菜莖桿組織段；
[0037] 以細(xì)菌性軟腐病常見寄主芹菜及黃瓜為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)試兩種植物材料人工接種致 病菌的接種效果。選取成熟期一致、生長(zhǎng)健康的芹菜及黃瓜莖桿組織，將中間部分切成長(zhǎng) 5cm的莖段。每個(gè)處理3次重復(fù)。采用莖段浸菌法接種細(xì)菌性軟腐病病原菌（見下面），接 種后置于適宜條件下保濕培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。
[0038] 芹菜及黃瓜組織莖段在接種細(xì)菌性軟腐病病原菌36h后均導(dǎo)致不同程度的發(fā)病。 在相同環(huán)境條件下芹菜莖段平均發(fā)病程度較黃瓜莖段更為嚴(yán)重。芹菜莖段在發(fā)病后植物 組織腐爛變軟，有菌膿溢出，并伴隨一定程度的臭味。發(fā)病部位顏色發(fā)生明顯變化，由其淺 綠色變?yōu)樯罹G色，發(fā)病組織與未發(fā)病組織區(qū)分明顯，分辨性強(qiáng)。黃瓜莖段發(fā)病后同樣腐爛變 軟，但發(fā)病組織顏色變化不明顯，人為分辨病害發(fā)生情況較困難。綜合發(fā)病速率及調(diào)查難易 程度，選取芹菜莖段為細(xì)菌性軟腐病病原菌人工接種的植株材料。
[0039] 在本發(fā)明中，所述的芹菜為市場(chǎng)上常見的西芹類及本芹類芹菜品種。
[0040]B、接種處理
[0041] 將步驟A得到的芹菜莖桿組織段豎直碼放在盛有濃度為1-5X108cfu/ml胡蘿卜 軟腐果膠桿胡蘿卜亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株（Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)菌 懸液的保濕盒內(nèi)，讓0. 5~1. 0cm芹菜莖桿組織段浸泡在所述菌懸液中；然后取出，再以水 平方式均勻碼放在濾紙上，在室溫下自然風(fēng)干，得到一種接種病原菌的芹菜莖桿組織段。
[0042] 將步驟A選取的芹菜莖桿組織段用于接種方式的篩選，試驗(yàn)了兩種病原菌接種方 法。
[0043] I、莖桿浸菌法：讓已處理植物組織按照每個(gè)處理量用皮筋綁好，豎直碼放，莖段一 端在IX108cfu/ml的菌懸液中浸泡40min后取出。自然風(fēng)干lh，再放入20X40cm保濕盒 內(nèi)，盒內(nèi)鋪置2層白色濾紙，清水淋濕，在適宜條件下保濕培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。
[0044] II、表面噴施法：讓已處理植物材料直接放入保濕盒內(nèi)碼放整齊，采用小型噴霧器 向莖桿裸露表面噴施1X108cfu/ml的菌懸液，噴菌量以菌液剛好覆蓋整個(gè)表面為宜，不應(yīng) 過多。自然風(fēng)干lh后在適宜條件下保濕培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。
[0045] 試驗(yàn)結(jié)果表明，莖桿浸菌法與表面噴施法均導(dǎo)致芹菜組織在短時(shí)間內(nèi)充分發(fā)病， 36h后芹菜莖段組織幾乎全部發(fā)病。從侵染過程來看，對(duì)于莖桿浸菌法，芹菜莖段一端浸菌， 該組織由一端開始發(fā)病，莖桿發(fā)病程度可以通過病原菌侵染長(zhǎng)度進(jìn)行判斷，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 制定較簡(jiǎn)單。而表面噴施由于莖桿表面全部接觸菌懸液、組織侵染部位不統(tǒng)一，發(fā)病部位零 散，需要通過發(fā)病組織面積判斷侵染程度。人的肉眼無法直接計(jì)算面積的大小，因此病情分 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定較困難。雖然噴菌法較為省時(shí)省力，但考慮到病級(jí)制定及調(diào)查簡(jiǎn)易程度，選取莖 桿浸菌法為芹菜莖段細(xì)菌性軟腐病人工接種方法。
[0046] 本發(fā)明使用的菌懸液制備步驟如下：將胡蘿卜軟腐果膠桿胡蘿卜亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株在 含有l(wèi)〇g/L蛋白胨、3g/L牛肉粉與5g/L氯化鈉的NB液體培養(yǎng)基中在溫度26~30°C與轉(zhuǎn) 速120~130rpm的條件下振蕩培養(yǎng)22~26h，得到濃