一株刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，采用基因工程技 術(shù)，使刺糖多孢菌中的鼠李糖生物合成基因的拷貝數(shù)增加，獲得殺菌素高產(chǎn)菌株s.SP-RM。
【背景技術(shù)】
[0002] 多殺菌素及其衍生物同時(shí)具有高效的殺蟲活性及綠色安全的優(yōu)良特性，成為近幾 年生物殺蟲制劑研宄領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，而野生菌株極低的發(fā)酵產(chǎn)量是阻礙多殺菌素進(jìn)一步 研宄的難題。多殺菌素通過與煙堿乙酰膽堿受體結(jié)合使昆蟲神經(jīng)細(xì)胞去極化，引起中央 神經(jīng)系統(tǒng)超活化，從而導(dǎo)致非功能性肌收縮、衰竭和麻痹，因此它對(duì)昆蟲有快速觸殺和攝 食毒性。多殺菌素殺蟲譜十分廣泛，包括鱗翅目（Lepidoptera)、纓翅目（Thysanoptera)、 鞘翅目（Coleoptera)、膜翅目（Hymenoptera)、雙翅目（Diptera)等害蟲，尤其對(duì)鱗翅目、 纓翅目害蟲有極強(qiáng)的選擇性殺蟲活性。多殺菌素具有諸多衍生物，到目前為止，由刺糖多 孢菌所產(chǎn)生的多殺菌素共分離得到30多種，其中包括9種缺少福樂糖基的擬糖苷配基 (Pseudoaglycone，PSA)，多殺菌素?cái)M糖苷配基也可用作進(jìn)一步化學(xué)修飾的底物，并產(chǎn)生新 的帶有獨(dú)特性質(zhì)和活性譜的半合成多殺菌素。
[0003]目前國際上關(guān)于多殺菌素合成機(jī)制的研宄仍處在起步階段，野生型刺糖多孢菌菌 株中多殺菌素產(chǎn)量極低，因此如何提高其發(fā)酵產(chǎn)量是亟待解決的一大難題。多殺菌素的合 成量極低，采用各種途徑如培養(yǎng)基優(yōu)化、理化誘變和分子遺傳改造等方法對(duì)其進(jìn)行菌種改 良是非常有必要的。利用基因工程技術(shù)對(duì)刺糖多孢菌基因組進(jìn)行定向遺傳修飾，有望成為 提尚多殺菌素廣量有效方法。
[0004]NDP-鼠李糖同時(shí)參與刺糖多孢菌的初級(jí)代謝與次級(jí)代謝過程，既是刺糖多孢菌菌 株細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組分，也是其次級(jí)代謝物多殺菌素的重要活性成分。NDP-鼠李糖的合成首先 通過NDP-葡萄糖合成酶（以編碼）將葡萄糖-1-磷酸催化成核苷二磷酸葡萄糖，然后由 葡萄糖脫氫酶（識(shí)*編碼）將NDP-D-葡萄糖催化生成NDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖，再由 3'，5' -表異構(gòu)酶（印/編碼）和酮還原酶（編碼）將NDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖轉(zhuǎn) 化成NDP-鼠李糖。然而，四個(gè)鼠李糖生物合成基因在5： 菌株基因組上都只有一個(gè) 拷貝數(shù)，且不存在于多殺菌素基因簇中，而是分散在染色體的不同位置。
[0005] 但現(xiàn)有將基因整合至刺糖多孢菌基因組中的技術(shù)均比較困難，如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技 術(shù)和接合轉(zhuǎn)移技術(shù)成功概率均比較低。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株刺糖多孢菌鼠李糖 生物合成基因加倍工程菌株，利用基因工程技術(shù)，通過定向遺傳修飾刺糖多孢菌，獲得多殺 菌素高產(chǎn)菌株。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一株刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因 加倍工程菌株，即刺糖多抱菌S.sp_RM，SaccharopolysporaspinosaS.sp-RM，于 2015 年6月8日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學(xué)）保藏，菌種 保藏號(hào)為CCTCCNO:M2015363。
[0008] 所述的刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，刺糖多孢菌染色體上整合 有含3'-0-甲基鼠李糖生物合成基因的質(zhì)粒pJNRM。
[0009] 本發(fā)明之鼠李糖合成基因加倍工程菌株的獲得步驟如下： (1) 接合轉(zhuǎn)移構(gòu)建工程菌株S.sp-RM及其PCR鑒定； (2) HPLC分析工程菌多殺菌素的生物合成能力； (3) 熒光定量RT-PCR分析鼠李糖基因的轉(zhuǎn)錄水平； (4) 比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析鼠李糖合成基因加倍對(duì)刺糖多孢菌蛋白表達(dá)水平的影響。
[0010] 本發(fā)明通過增加多殺菌素限速酶基因一一NDP-鼠李糖基因的拷貝數(shù)，獲得一株 鼠李糖合成基因加倍工程菌株。采用屬間接合轉(zhuǎn)移方法將含負(fù)責(zé)NDP-鼠李糖生物合成的 郝識(shí)*四個(gè)基因的功能載體pJNRM導(dǎo)入刺糖多孢菌中，獲得了NDP-鼠李糖合 成基因加倍的工程菌株S.sp-RM。PCR鑒定結(jié)果表明，該質(zhì)粒已成功地整合至刺糖多孢菌 基因組上；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，工程菌中識(shí)/Hre、6>/7i和以(基因的轉(zhuǎn)錄水平分 別比原始菌株提高了 80. 3倍、30. 8倍、23. 8倍和18. 3倍；HPLC檢測結(jié)果表明，工程菌S. sp-RM中多殺菌素產(chǎn)量比原始菌株提高73%。利用SDS-PAGE方法和1D-LC-MS/MS對(duì)工程 菌株S.sp-RM和原始菌株5：spiflosa的全蛋白進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)鼠李糖生物合成基因的 加倍不僅如預(yù)期猜測能影響鼠李糖和福樂糖胺的生物合成，而且能通過影響核糖體蛋白裝 載過程、PKS合成來調(diào)控刺糖多孢菌次級(jí)代謝過程。
[0011] 微生物保藏情況說明 本發(fā)明之刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，即刺糖多孢菌S.SP-RM，SaccharopolysporaspinosaS.sp-RM，于2015年6月8日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡 稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學(xué)）保藏，菌種保藏號(hào)為CCTCCNO:M2015363。
【附圖說明】
[0012] 圖1為接合子的PCR鑒定圖；M，DNAMarker;泳道1，陰性對(duì)照；泳道2,陽性對(duì)照； 泳道3-5，接合子S.sp-RM基因組為模板； 圖2 -A和圖2 -B為載體pJNRM整合位點(diǎn)的鑒定圖；A，載體可能的整合方式示意圖；B，PCR鑒定載體整合方式； 圖3 -A為工程菌株S.sp-RM(A)的HPLC分析圖； 圖3 -B為原始菌株51沙/加似（B)的HPLC分析圖； 圖4為rAa基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析； 圖5為SDS-PAGE分析原始菌與工程菌（72h)全蛋白圖； 圖6為差異蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0014] 實(shí)施例1 本實(shí)施例之刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，即刺糖多孢菌S.SP-RM， SaccharopolysporaspinosaS.sp-RM，于2015年6月8日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡 稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學(xué)）保藏，菌種保藏號(hào)為CCTCCNO:M2015363。
[0015](一）具體培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件 (1) 5：沙/加似種子活化采用SP-2培養(yǎng)基：葡萄糖9g/L，TrypticSoyBroth30g/ L，酵母提取物3g/L，硫酸鎂2g/L。接種單克隆或1%菌種保藏液加入裝有20mLSP-2的 250mL搖瓶中，30°C，300r/min培養(yǎng) 48-72h; (2) 轉(zhuǎn)接采用TSB培養(yǎng)基：TrypticSoyBroth30g/L。接種1%菌液加入裝有20mL SP-2 的 250mL搖瓶中，30 °C，300r/min培養(yǎng) 48-72h; (3) 發(fā)酵培養(yǎng)采用SP-3培養(yǎng)基：葡萄糖60g/L，可溶性淀粉10g/L，玉米漿7g/L，棉 籽粉22.5g/L，豆餅粉5g/L，酵母提取物2g/L，碳酸鈣5g/L，油酸甲酯42mL/L，微量元 素2. 5mL/L(氯化鈷0. 3g/L，硫酸鋅1. 4g/L，硫酸亞鐵3. 8g/L，硫酸鎳0. 5g/L，溶于 0. 5mol/L的鹽酸中），pH7. 0。接種10%菌種保藏液加入裝有20mLSP-3的300mL搖瓶 中，30°C，300r/min培養(yǎng) 10-12d; (4) 接合轉(zhuǎn)移米用R6固體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基（g/L):Sucrose200,Dextrin10,Casamino acids1，MgS04 ? 7H20 0? 05,K2S04 0? 1，F(xiàn)eS04 ? 7H20 0? 1，MnCl2 ? 4H20 0? 001，ZnS04 ? 7H20 0? 001，BHI13,Agar12,加入678mL蒸餾水，定容至1L，115 °C滅菌30min。待培養(yǎng)基 冷卻至50 °C加入以下三種經(jīng)0.22ym(微米)濾膜過濾除菌的物質(zhì)，1mol/LL-glutamic &(^(165 1111，1111〇1/1〇&(：12.21120 48 1111及1111〇1/1丙磺酸（]\?^5)5 111匕固體平板轉(zhuǎn)接 采用BHI固體培養(yǎng)基。
[0016](二）屬間接合轉(zhuǎn)移 首先將已構(gòu)建好的質(zhì)粒pJNRM電轉(zhuǎn)至凡coJ7S17,經(jīng)Trime、Str和Apr三抗篩選陽性 轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切鑒定獲得轉(zhuǎn)化子凡