cry1Ia基因及應(yīng)用、由其編碼的Cry1Ia蛋白及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及crylla基因及其應(yīng)用，由crylla基因的編 碼的CrylIa蛋白和編碼蛋白在寄生線蟲防治上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物寄生線蟲病是農(nóng)作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生線蟲所造成的作 物損失超過千億美元（Chiwold，2003)，線蟲病害已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一個突出問題。目前， 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常采用化學(xué)殺線蟲劑來防治植物寄生線蟲病害，但現(xiàn)今市場上殺線蟲劑的品種 有限，大部分為高毒、高殘留農(nóng)藥，長期單一地使用高毒、高殘留的化學(xué)殺線蟲劑，不僅對環(huán) 境造成了嚴重的污染，也引發(fā)了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標、線蟲抗藥性日益突出等系列環(huán)境 和社會問題。近年來，隨著人們對農(nóng)產(chǎn)品安全的日益關(guān)注，化學(xué)農(nóng)藥的使用越來越受到限 制，因此，研發(fā)有效的殺線蟲微生物以補充或替代化學(xué)殺線蟲劑就顯得日益迫切。
[0003] 蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是目前世界上應(yīng)用最 廣泛、最成功的微生物殺蟲劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、貯藏以及衛(wèi)生等領(lǐng)域的害蟲防 治。自從1961年Ciordia等首次發(fā)現(xiàn)Bt對牛腸道蛇形毛圓線蟲（thichostrongylus colubriformis)卵和幼蟲有殺滅作用以來，Bt的殺線蟲作用才逐漸引起人們的關(guān) 注。國內(nèi)外已報道的具有殺線蟲活性的Bt菌株主要包括Bt蘇云金亞種（B.t.subsp. thuringiensis)、以色列亞種（Β· t. subsp. Israelensis)、庫斯塔克亞種（Β· t. subsp. Kurstaki)和莫里斯亞種（B.t.subsp. Morris)。這些菌株對多種植物線蟲具有生物活性， 如酸醬線蟲（Panagrellus redivivus)、南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita)、穿刺短 體線蟲（Pratylenchus penetrans)和大豆抱囊線蟲（Heterodera glycines)等（Schnepf， 1998)〇
[0004] 1985年Bone等首次證實了 Bt伴胞晶體蛋白（δ -內(nèi)毒素）對線蟲的作用活性， 2003年Wei等研宄了不同基因產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白對幾種自由生活線蟲的毒性，從兩個主 要的Β. t.晶體蛋白亞家族中表達出了 7種不同的晶體毒素蛋白，通過測試這些晶體毒素蛋 白對自由生活的線蟲毒性，證實了其中4種晶體毒素蛋白（Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A) 對多種線蟲種類均有活性，所測試的線蟲至少對一種晶體毒素蛋白敏感，從而明確提出Bt 晶體毒素蛋白具有殺線蟲能力（Wei JZ, 2003)。B.t.晶體毒素蛋白是由毒素蛋白基因 （cry 基因）編碼的，不同蘇云金芽胞桿菌亞種或菌株所具有的cry基因不同。1988年以來，美國 Mycogen公司分離到一些對秀麗新小桿線蟲、短體線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲等有毒性的蘇云金 芽胞桿菌，并從這些菌株中克隆了一些殺線蟲毒素蛋白基因（參見http://appft. uspto. gov/netacgi)。到目前為止，全世界從B.t.菌株中已分離到的殺線蟲基因主要有cryl、 cry5、cry6、cryl2、cryl3、cryl4以及cry21幾大類，但數(shù)量十分有限，而且這些菌株、伴 胞晶體蛋白及伴胞晶體蛋白基因幾乎都以專利的形式加以保護，所涉及的菌株也多使用代 號。因此，分離鑒定新的殺線蟲Bt菌株與伴胞晶體蛋白引起國內(nèi)外科學(xué)家的廣泛重視。
[0005] cry I Ia基因是cry基因家族中非常特殊的cry 1類基因，最先由Tailor等 從B.thuringiensis菌株4835中克隆，該基因編碼一個81KD的蛋白，對鱗翅目的夜蛾 科（Noctuidae)、卷葉蛾科（Tortricidae)、菜蛾科（Plutellidae)和鞘翅目的葉甲科 (Chrysomelidae)的害蟲具有較好的殺滅效果。crylla基因在大都數(shù)Bt菌株中被沉默而沒 有表達產(chǎn)物（(Kostichka et al, 1996)，其主要原因在cryll基因編碼區(qū)上游一般與cryl 類基因相鄰，稱為cryl-cryll連鎖，造成了 cryll基因自身啟動子的缺乏。
[0006] 盡管crylla基因在Bt菌株中普遍被沉默，但已有多個基因被克隆，全球分離克隆 的crylla基因有13種。但是目前為止，克隆獲得的crylla基因及表達蛋白的殺蟲作用僅 限于鱗翅目和鞘翅目害蟲，還沒有crylla基因及表達產(chǎn)物對植物寄生線蟲具有作用活性 的相關(guān)研宄報道。
[0007] 湖南省植物保護研宄所分離了一種蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis) 菌株YC-IO，并將其保藏至中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC)，保藏單位地址位于中國 武漢大學(xué)，保藏日期2010年1月21日，保藏號為CCTCC NO :M 2010023。研宄發(fā)現(xiàn)蘇云金 芽胞桿菌YC-10產(chǎn)生的伴胞晶體對植物寄生線蟲具有較高的生物活性。然而，該菌株產(chǎn)生 的伴胞晶體蛋白是由多種成分組成的混合物，不僅未明確具體殺線蟲活性蛋白，且蛋白產(chǎn) 量低，導(dǎo)致伴胞晶體抽提物在植物寄生線蟲防治上很難廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從蘇云金芽孢桿菌 中分離得到的crylla基因，該crylla基因可應(yīng)用于殺線蟲的防治；本發(fā)明還提供了由 crylla基因編碼的CrylIa蛋白及其制備方法和應(yīng)用，CrylIa蛋白使之表現(xiàn)出對植物寄生 線蟲的毒性，具有高效、低毒、生態(tài)環(huán)保、且能有效減少農(nóng)藥殘留等優(yōu)勢，可做為新型的生物 農(nóng)藥。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] 種crylla基因，優(yōu)選的，所述crylla基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列。
[0011] 作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述crylla基因在防治寄生線蟲 中的應(yīng)用。
[0012] 上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，將crylla基因轉(zhuǎn)化植物，得到抗線蟲植株的新品種。
[0013] 上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，將crylla基因轉(zhuǎn)化微生物，獲得可高效表達用于防治線蟲 的蛋白，表達的蛋白可制成生物農(nóng)藥用于防治植物線蟲病害。
[0014] 作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述crylla基因編碼的CrylIa蛋 白。
[0015] 上述的CrylIa蛋白，優(yōu)選的，所述CrylIa蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示 的序列。
[0016] 作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述的CrylIa蛋白的制備方法，其 特征在于，所述CrylIa蛋白的制備方法具體包括以下步驟：
[0017] S1、以SEQ ID NO. 3所示的序列和SEQ ID NO. 4所示的序列為引物，對所述crylla 基因進行PCR擴增得到擴增產(chǎn)物；
[0018] S2、將所述擴增產(chǎn)物與載體連接得到重組子；
[0019] S3、將所述重組子轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中得到轉(zhuǎn)化子；
[0020] S4、將所述轉(zhuǎn)化子進行活化、表達，得到CrylIa蛋白。
[0021] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S2中所述載體為pQE30。
[0022] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S4具體為：
[0023] S4-1、將所述轉(zhuǎn)化子涂布于LB平板中，培養(yǎng)過夜得到培養(yǎng)液；
[0024] S4-2、將所述培養(yǎng)液接種于LB培養(yǎng)基中進行放大培養(yǎng)；
[0025] S4-3、加入誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)4~12h ;
[0026] S4-4、搜集所述步驟S4-3培養(yǎng)得到的菌體進行超聲破碎、離心得到CrylIa蛋白。
[0027] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S4-1中所述LB平板中含有100 μ g/L的氨芐 青霉素。
[0028] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S4-2中將所述培養(yǎng)液方法培養(yǎng)至0D600為 0. 6 ~0. 7。
[0029] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S4-3中，所述誘導(dǎo)劑為異丙基-β -D-硫代半 乳糖苷。
[0030] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S4-3中，所述誘導(dǎo)劑的濃度為0. 5mM。
[0031] 作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述的CrylIa蛋白或所述制備方 法制備得到的CrylIa蛋白在防治寄生線蟲中的應(yīng)用。
[0032] 上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述寄生線蟲為根結(jié)屬線蟲或孢囊屬線蟲。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0034] (1)本發(fā)明提供了一種從蘇云金芽胞桿菌YC-10分離得到的crylla基因，將 crylla基因轉(zhuǎn)化植物或微生物，獲得可高效表達用于防治線蟲的蛋白，表達的蛋白可制成 生物農(nóng)藥用于防治植物線蟲病害；還可以獲得抗線蟲植株的新品種，對線蟲的防治效果好， 致死率高。
[0035] ⑵本發(fā)明提供了一種由crylla基因編碼得到的CrylIa蛋白，20mg/L處理南方 根結(jié)線蟲、大豆孢囊線蟲J2,96h致死率達100%，不僅高效低毒，而且可以有效減少化學(xué) 農(nóng)藥的使用，降低化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染，并能減少線蟲抗藥性的產(chǎn)生，進而有利于環(huán)境保 護，減少農(nóng)產(chǎn)品上的農(nóng)藥殘留，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。
[0036] (3)本發(fā)明開拓了植物寄生線蟲生物防治的新途徑，擴大了適用于植物寄生線蟲 的生物農(nóng)藥資源。
【附圖說明】
[0037] 為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例 中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述。
[0038] 圖1蘇云金芽孢桿菌YC-10形態(tài)特征圖。
[0039] 圖2為本發(fā)明實施例2中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，M為DNA Marker， ck為陰性對照。
[0040] 圖3為本發(fā)明實施例2中pQE30-cry