一種帶魚魚肉蛋白抗氧化肽及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到蛋白抗氧化肽，具體指涉及一種帶魚魚肉蛋白抗氧化肽及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗氧化劑是一類可以減弱或者祛除自由基對(duì)人體損害和保護(hù)食品免受氧化損傷變質(zhì)的一類物質(zhì)。目前，化學(xué)合成抗氧化劑由于價(jià)格便宜，被廣泛地應(yīng)用到食品工業(yè)中。但是，化學(xué)合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等，在不同程度上損傷人體的肝臟、腎臟等器官。因此，部分國(guó)家和地區(qū)已經(jīng)明確限量或禁止使用對(duì)人體有毒副作用的化學(xué)合成抗氧化劑。尋找高效、安全的天然抗氧化劑替代化學(xué)合成抗氧化劑成為研宄熱點(diǎn)，而抗氧化肽由于其食用安全、利用度高、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛重視。
[0003]帶魚又叫刀魚、裙帶、肥帶、油帶、牙帶魚等，屬于脊索動(dòng)物、脊椎動(dòng)物亞門、硬骨魚綱、鱸形目、帶魚科，主要分布于西太平洋和印度洋，在我國(guó)的黃海、東海、渤海和南海均有分布。帶魚富含脂肪、蛋白質(zhì)、維生素A、不飽和脂肪酸、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有暖胃、澤膚、補(bǔ)氣、養(yǎng)血、健美以及強(qiáng)心補(bǔ)腎、舒筋活血、消炎化痰、清腦止瀉、消除疲勞、提精養(yǎng)神之功效。
[0004]但是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，以帶魚魚肉為原料，利用酶解技術(shù)制備帶魚魚肉抗氧化肽的工藝研宄處于空白階段，而以酶解產(chǎn)物為材料制備高活性抗氧化肽及其應(yīng)用更是未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀提供一種能夠清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用的帶魚魚肉蛋白抗氧化肽，其可作為藥品、保健食品和食品的安全添加劑。
[0006]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備方法。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:該帶魚魚肉蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽為八肽化合物，氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp(NWDMEKIff)，ES1-MS 測(cè)定分子量為 1121.25 Da。
[0008]上述帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括下述步驟:
1)帶魚魚肉預(yù)處理:取帶魚魚肉用高速組織搗碎機(jī)處理成勻漿，加熱至80~100°C后保溫5~10min，然后按照料液比lg:2~4mL加入異丙醇，于20~25°C脫脂18~24 h，然后于4°C、4500-6000 rpm離心15~20min除去異丙醇，收集脫脂帶魚魚肉固形物；
2)帶魚魚肉蛋白的酶解:將上述脫脂帶魚魚肉固形物按固液比lg:20~25mL加入磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.5~7.5)，混合液溫度升至55~65°C攪拌預(yù)熱10~15 min，按脫脂帶魚魚肉固形物質(zhì)量的1.0-1.5%加入protamex復(fù)合蛋白酶，在55~65°C酶解4~6 h ;然后將酶解液升溫至90~95°C后恒溫保持10~15 min，將酶解液溫度降至45~50°C，按脫脂帶魚魚肉固形物質(zhì)量的1.5-2.0%加入中性蛋白酶，在45~50°C酶解3~5 h，冷卻至20~25°C，于5000~6000 rpm離心20~25min，除去沉淀物，得到酶解液；
3)帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得到超濾酶解液，將超濾酶解液按照體積比加入到裝有8?10倍D201大孔樹脂的層析柱中，用3?5倍柱體積水洗脫除去雜質(zhì)，然后用5?8倍柱體積的30%乙醇進(jìn)行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經(jīng)陽(yáng)離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到帶魚魚肉蛋白抗氧化肽。
[0009]作為優(yōu)選，所述的步驟I)中的帶魚為日本帶魚(cAitf/YAs japonicus)。
[0010]作為優(yōu)選，所述步驟4)的陽(yáng)離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過(guò)程為:
陽(yáng)離子交換樹脂層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為45~50 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂(732)層析柱分離，收集雙蒸水洗脫組分，即為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為15~20 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)230 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高羥基自由基清除活性的峰為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80~100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對(duì)羥基自由基的清除活性得I個(gè)高抗氧化活性多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp (NWDMEKIff)。
[0011]再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量10~15 μ L ;色譜柱Kromasil C18 (250mmX4.6 mm, 5 μ m);流動(dòng)相:40%乙腈；洗脫速度0.8-1.0 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的帶魚魚肉蛋白抗氧化肽對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時(shí)，Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp(NWDMEKIff)亦顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用；Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1Ie-Trp(NWDMEKIff)具有安全無(wú)毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1是本發(fā)明的葡聚糖凝膠Sephadex G_25層析圖。
[0014]圖2葡聚糖凝膠S印hadex G-25制備酶解物的RP-HPLC分析。
[0015]圖 3 Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp 的質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0017]帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:帶魚魚肉〃脫脂〃酶解〃酶解物"超濾"大孔樹脂純化"陽(yáng)離子交換層析"凝膠過(guò)濾層析"高效液相色譜制備"抗氧化肽。
[0018]具體步驟為:
1)帶魚魚肉預(yù)處理:取日本帶魚(Trichiurusjaponicus)魚肉用高速組織搗碎機(jī)處理成勻漿，加熱至85°C后保溫lOmin，然后按照料液比lg:4 mL加入異丙醇，于25°C脫脂24h，然后于4°C、6000 rpm離心15 min除去異丙醇，收集脫脂帶魚魚肉固形物；
2)帶魚魚肉蛋白的酶解:將上述脫脂帶魚魚肉固形物按固液比lg:25mL加入磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L, pH 7.0)，混合液溫度升至60°C攪拌預(yù)熱10 min，按脫脂帶魚魚肉固形物質(zhì)量的1.5%加入protamex復(fù)合蛋白酶，在60°C酶解4~6 h ;然后將酶解液升溫至95°C后恒溫保持15 min，將酶解液溫度降至50°C，按脫脂帶魚魚肉固