一種具有良好抗非特異性蛋白質(zhì)吸附性能的隱形多肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多肽及其制備方法，具體地說是一種具有良好抗非特異性蛋白質(zhì) 吸附性能的隱形多肽及其制備方法。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 對于生物材料而言，依然沒有完全解決的一個問題是材料表面的非特異性蛋白質(zhì) 吸附。它是導(dǎo)致血栓形成、炎癥反應(yīng)，甚至生物材料失效的主要因素之一。聚乙二醇（PEG) 在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域有廣泛的用途，但是在長期與生理血液接觸的條件下，它容易氧化，甚 至被降解。一般認(rèn)為，兩性離子類抗非特異性蛋白質(zhì)吸附材料的穩(wěn)定性比PEG優(yōu)良，其中 最典型的是羧基甜菜堿（CBM)、磺酸基甜菜堿（SBM)以及磷酰膽堿（MPC)等，它們都屬于 甲基丙烯酸酯類材料。但是，當(dāng)PEG類以及甲基丙烯酸酯類聚合物作為基因或者納米藥物 載體時，在長期給藥的情況下，由于其生物不可降解性，宿主細(xì)胞缺乏相應(yīng)的代謝機(jī)制從而 造成聚合物在細(xì)胞內(nèi)的累積，這樣會干擾宿主細(xì)胞的正常代謝，對宿主細(xì)胞造成傷害甚至 引起宿主細(xì)胞死亡。多肽類材料由于其良好的生物相容性和生物可降解性而引起廣泛的關(guān) 注。Chen S.F.等通過谷氨酸N-羧基內(nèi)酸酐（Glu-NCA)和賴氨酸N-羧基內(nèi)酸酐（Lys-NCA) 混合開環(huán)聚合（ROP)的方法得到了具良好抗非特異性蛋白質(zhì)吸附性能的多肽。但是，由于 兩種單體的反應(yīng)活性差異以及不同批次的單體純度難以控制而很難得到正負(fù)電荷均勻分 布的多肽。Jiang S.Y.組通過固相有機(jī)合成方法制備出由帶負(fù)電荷的谷氨酸（E)和帶正 電荷的賴氨酸（K)構(gòu)成的含4-6個EK單元的寡肽，它顯示了良好的抗非特異性蛋白質(zhì)吸 附性能。但是該方法依賴于氨基酸合成儀，效率低、耗費(fèi)大，尤其對于大分子量多肽而言制 備效率更低。Chen H.等設(shè)計(jì)了由寡乙二醇甲基丙烯酰氯（OEGMA-Cl)與保護(hù)性賴氨酸的 α -氨基反應(yīng)得到的賴氨酸寡乙二醇甲基丙烯酸酯（OEGMA-Iysine)，經(jīng)聚合后得到的高聚 物具有由OEG提供的優(yōu)良抗非特異性蛋白質(zhì)吸附性能以及由賴氨酸側(cè)鏈提供的與纖溶酶 原（plasminogen)特異性結(jié)合的功能。盡管這種材料顯示了良好的抗非特異性蛋白質(zhì)吸附 性能，但其生物不可降解性問題依然存在。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明旨在提供一種具有良好抗非特異性蛋白質(zhì)吸附性能的隱形多肽及其制備 方法，能解決經(jīng)典的聚甲基丙烯酸酯類抗非特異性吸附蛋白質(zhì)材料的生物不可降解性等難 題。所謂隱形，是指材料本身能阻止蛋白質(zhì)在其表面的非特異性吸附，避免了被人體免疫系 統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并被清除，甚至引起機(jī)體排異反應(yīng)的機(jī)會，從而實(shí)現(xiàn)對人體免疫系統(tǒng)的隱身。
[0004] 本發(fā)明具有良好抗非特異性蛋白質(zhì)吸附性能的隱形多肽的結(jié)構(gòu)式如下：
[0005]
[0006] 其中，η表示兩種單體的聚合度，η = 10-30。
[0007] 本發(fā)明具有良好抗非特異性蛋白質(zhì)吸附性能的隱形多肽的制備過程如下：
[0008] 1)縮合
[0009] 將保護(hù)性賴氨酸、保護(hù)性天冬氨酸、縮合劑以及消旋抑制劑溶于有機(jī)溶劑中，在氮 氣氣氛中于室溫下密閉反應(yīng)48h ;反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，得黃色油狀物；將 黃色油狀物溶于乙酸乙酯中，依次用IOwt. % (質(zhì)量濃度，下同）檸檬酸溶液、飽和碳酸氫鈉 溶液和飽和食鹽水洗滌，分液，收集有機(jī)相；有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋蒸脫除溶劑，硅 膠柱色譜分離（流動相：二氯甲烷/乙酸乙酯=3 :1(體積比））得中間體1，為白色固體， 直接用于下一步反應(yīng)；
[0010] 中間體1的結(jié)構(gòu)式如下：
[0011]
[0012] 其中，札為
[0013] 馬為
[0014] 因?yàn)槭惺鄣谋Ｗo(hù)性賴氨酸一般結(jié)構(gòu)中均含有一個HC1，所以在反應(yīng)前需要進(jìn)行預(yù) 處理，以三乙胺（TEA)脫去結(jié)構(gòu)中的HCl使賴氨酸中的氨基游離出。
[0015] 所述保護(hù)性賴氨酸選自
[0016]
[0017] 所述保護(hù)性天冬氨酸選自
[0018]
[0019] 步驟1)中所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC ·Ηα)等；所述消旋抑制劑為1-羥基苯并三氮唑（HOBt)或1-羥 基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAt)等。
[0020] 步驟1)中保護(hù)性賴氨酸、保護(hù)性天冬氨酸、縮合劑和消旋抑制劑的摩爾比為 1:1:2:2〇
[0021] 所述乙酸乙酯、IOwt. %檸檬酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水的體積分別 為反應(yīng)液體積的8-10倍。
[0022] 步驟1)中所述有機(jī)溶劑為N，N-二甲酰胺（DMF)或二甲亞砜。
[0023] 2)脫保護(hù)基
[0024] 將中間體1加入到三氟乙酸（TFA)/CH2Cl2 (V/V = 2 :1)中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，旋蒸 脫除溶劑，將殘留物再一次溶在CH2Cl2*，加 TEA調(diào)pH至7-8,再次旋蒸脫除溶劑；水洗殘 留物后過濾并干燥，得中間體2,為白色固體；
[0025] 中間體2的結(jié)構(gòu)式如下：
[0028] 3)縮聚[0029] 將中間體2、縮合劑及消旋抑制劑按摩爾比1:2:2的比例加入到有機(jī)溶劑中，氮?dú)?br>[0026]
[0027] 其中，札為 氣氛中于室溫下密閉反應(yīng)48h，然后將反應(yīng)液倒入乙醚中沉淀得聚合物為中間體3,不經(jīng)純 化直接用于下一步反應(yīng)；步驟3)中所述有機(jī)溶劑為DMF或二甲亞砜。
[0030] 中間體3的結(jié)構(gòu)式如下：
[0031]
[0032] 其中，札為
[0033] 步驟3)中所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC ^HCl)等；所述消旋抑制劑為1-羥基苯并三氮唑（HOBt)或1-羥 基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAt)等。
[0034] 4)脫保護(hù)基
[0035] 將步驟3)得到的中間體3溶于混合溶液中室溫下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液傾 入乙醚中得黃色油狀物；
[0036] 當(dāng)&為
I時，所述混合溶液為50wt. %的哌啶的CH2Cl2溶液；
[0037] 當(dāng)&為
時，所述混合溶液是由33wt. %的HBr的乙酸溶液和TFA 按體積比1:1構(gòu)成。
[0038] 5)產(chǎn)物的純化
[0039] 將步驟4)得到的黃色油狀物溶于水中，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7-8,透析，凍 干得白色固體，即為目標(biāo)產(chǎn)物。所述透析是指在重蒸水中透析3天，每隔12h換水一次。所 述凍干是指在真空度13Pa、-45°C條件下凍干。
[0040] 在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明設(shè)計(jì)并制備了一種由聚天冬氨酸帶賴氨酸側(cè)鏈的多 肽，由于其良好的抗蛋白吸附性能，不容易引起機(jī)體的免疫和排異反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了對機(jī)體 免疫系統(tǒng)的隱形性能；其次基于天然氨基酸的多肽由于其良好的生物可降解性能解決了 經(jīng)典的聚甲基丙烯酸酯類和PEG類抗非特異性吸附蛋白質(zhì)材料的生物不可降解性等難題。 核磁共振波譜（1HNMR)證實(shí)已成功得到目標(biāo)多肽；采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜 (ATR-FTIR)和酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA)考察了這種多肽自組裝單分子膜（SAMs)的結(jié) 構(gòu)以及它的抗非特異性蛋白質(zhì)吸附性能。 四、
【附圖說明】
[0041] 圖1是目標(biāo)多肽的凝膠滲透色譜（GPC)圖。從圖1中可以看出已經(jīng)成功制備得到 目標(biāo)多肽，其重均分子量（Mw)約為3. 8kDa，多分散系數(shù)（PDI)為1. 33。
[0042] 圖2是目標(biāo)多肽的核磁共振圖譜（1HNMR)。從圖2中可以看出已經(jīng)成功制備得到 目標(biāo)多肽，并且對相應(yīng)的氫原子進(jìn)行了指認(rèn)。
[0043] 圖3是多肽在金片上的自組裝單分子膜（SAMs)的衰減全反射傅里葉變換紅外 光譜（ATR-FTIR)圖。從圖3中可以看出二級酰胺的兩個特征吸收區(qū)：酰胺I帶（v。= V 1600-1700(^1)和酰胺II帶（δ N_H，1500-1600(^1)，表明在金片表面已經(jīng)形成了多肽SAMs。
[0044] 圖4是多肽SAMs表面對抗人免疫球蛋白（anti-IgG)和纖維蛋白原（Fg)的相對 非特異性蛋白質(zhì)吸附量。從圖4中可以看出選取anti-IgG以及Fg作為模型蛋白質(zhì)，二者 的相對非特異性蛋白質(zhì)吸附量分別為8. 5±3. 6%和12. 5±4. 8%。 五、
【具體實(shí)施方式】
[0045] 1、縮合
[0046] δ - ( α -芐基-Nε -芐