ransformation),實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志（Journal of Experimental Botan)，49 (326) : 1589-1595)、查克拉瓦蒂（Chakravarty)等人，（通過改善影響農(nóng)桿 菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的因素在馬鈴薯培養(yǎng)物中快速再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體（Rapid regeneration of stable transformants in cultures of potato by improving factors influencing Agrobacterium-mediated transformation)，生物科學(xué)和生物技術(shù)進(jìn)展（Advances in Bioscience and Biotechnology)，2010, 1:409-416)、巴雷爾（Barrell)等人，（使用最 少T-DNA載體的馬鈴薯轉(zhuǎn)化的替代可選標(biāo)記物（Alternative selectable markers for potato transformation using minimal T-DNA vectors，Plant Cell)，植物細(xì)胞、組織和 器官培養(yǎng)（Plant Cell，Tissue and Organ Culture)，第 70 卷，第1 號(hào)（2002)，61_68)、 安德森（Andersson)等人，（使用突變AHAS基因的馬鈴薯轉(zhuǎn)化的新選擇系統(tǒng)（A novel selection system for potato transformation using a mutated AHAS gene)，植物細(xì) 胞報(bào)告（Plant Cell R印.），2003, 22(4) :261-267)、瓦爾科維（Valkov)等人，（通過替代 性50和30個(gè)調(diào)節(jié)序列在馬鈴薯中的高效質(zhì)體轉(zhuǎn)化和葉子以及塊莖中的轉(zhuǎn)殖基因表達(dá)調(diào)節(jié) (High efficiency plastid transformation in potato and regulation of transgene expression in leaves and tubers by alternative 50 and 30regulatory sequences), 轉(zhuǎn)基因研究（Transgenic Res) (2011)20:137-151)和塔瓦扎（Tavazza)等人（馬鈴薯的 遺傳轉(zhuǎn)化：獲得轉(zhuǎn)基因植物的有效方法（Genetic transformation of potato(Solanum tuberosum) :An efficient method to obtain transgenic plants),植物科學(xué)（Plant Science)，第59卷，第2期，1989,第175-181頁），其中的每一者以全文引用的方式并入 本文中。
[0098] 育種方法
[0099] 馬鈴薯的一般育種方法描述于（但不限于）以下文獻(xiàn)中：作物植物的雜 交（Hybridization of crop plants)(美國農(nóng)學(xué)會(huì)和美國農(nóng)作物學(xué)會(huì)（American Society of Agronomy and Crop Science Society of America)，1980，第 34 章）、 布拉德肖等人，（基因資源和其用于馬鈴薯育種中的進(jìn)展（Genetic Resources and Progress in Their Utilization in Potato Breeding),馬鈴薯石開究(Potato Research)，2006, 49:49-65)、巴龍（Barone)(用于馬鈴薯育種的分子標(biāo)記物輔助選擇 ((Molecular Marker-assisted Selection for Potato Breeding)，美國馬鈴薯研究雜 志（Amer.J. of Potato Res. )2004,81:111-117)、杜奇斯（Douches)等人，（上世紀(jì)美國 馬鈴薯育種進(jìn)展評(píng)估（Assessment of Potato Breeding Progress in the USA over the Last Century)，作物科學(xué)（Crop Science)，36(6): 1544-1552)、馬鈴薯化學(xué)和技 術(shù)進(jìn)步（Advances in Potato chemistry and Technology)(學(xué)術(shù)出版社，2009, ISBN 0123743494,9780123743497,第 8 章，馬鈴薯育種策略（Potato Breeding Strategy), 布拉德肖）和雅尼克（Janick)等人（經(jīng)由倍性操作的馬鈴薯育種（Potato Breeding via Ploidy Manipulations),植物育種綜述（Plant Breeding Reviews), 2010)。其 它育種方法已為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知，例如論述于以下文獻(xiàn)中的方法：查 哈爾（Chahal)和格薩爾（Gosal)(植物育種的原理和程序：生物技術(shù)和常規(guī)方法 (Principles and procedures of plant breeding:biotechnological and conventional approaches), CRC 出版社，2002, ISBN 084931321X, 9780849313219)、塔吉（Taji)等人 (體外植物育種（In vitro plant breeding),勞特利奇（Routledge) ,2002, ISBN156022 908X, 9781560229087)、理查茲（Richards)(植物育種系統(tǒng)（Plant breeding systems), 泰勒（Taylor)和弗朗西斯（Francis)US, 1997, ISBN 0412574500, 9780412574504)、海斯 (Hayes)(植物育種方法（Methods of Plant Breeding),出版商：READ BOOKS, 2〇〇7, IS BN1406737062, 9781406737066)，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中。
[0100] 典型育種方法可以包括于本發(fā)明中以將一或多個(gè)本發(fā)明的重組表達(dá)盒引入到其 它植物品種，或與本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物雜交相容的其它密切相關(guān)種中。
[0101] 自由授粉群體.如黑麥、許多玉米和甜菜的農(nóng)作物、禾本科牧草、如苜蓿和三葉草 的豆科植物和如可可、椰子、油棕和一些橡膠的熱帶樹作物的自由授粉群體的改良基本上 取決于朝向固定有利等位基因改變基因頻率，同時(shí)維持高（但遠(yuǎn)離最大）程度的異型接合 性。所述群體中的均一性為不可能的且自由授粉品種的典型性為群體總體上的統(tǒng)計(jì)特征， 而不是個(gè)體植物的特征。因此，自由授粉群體的異質(zhì)性與近交品系、克隆體和雜種的均質(zhì)性 (或幾乎如此）形成對(duì)比。
[0102] 群體改良方法自然地落入兩組，基于純表現(xiàn)型選擇的方法，通常稱作混合選擇，和 基于通過后代測試的選擇的方法。群體間改良利用開放育種群體的概念；允許基因從一個(gè) 群體流動(dòng)到另一群體。一個(gè)群體（栽培品種、品系、生態(tài)型或任何胚質(zhì)源）中的植物自然地 (例如通過風(fēng)）或通過手工或通過蜜蜂（通常原種意大利蜜蜂（Apis mellifera L )或苜 蓿切葉蜂（Megachile rotundata F.))與來自其它群體的植物雜交。選擇通過分離來自兩 個(gè)來源的具有所需特性的植物應(yīng)用于改良一個(gè)（或有時(shí)兩個(gè)）群體。
[0103] 基本上存在兩種自由授粉群體改良的主要方法。第一，存在群體通過所選的選擇 程序全體改變的情況。結(jié)果為孤立地在自身內(nèi)通過隨機(jī)交配無限可繁殖的改良群體。第 二，合成品種與群體改良達(dá)到相同最終結(jié)果，但就其本身來說不可繁殖；其必須從親本品系 或克隆體經(jīng)重構(gòu)。改良自由授粉群體的這些植物育種程序?yàn)樗鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周 知并且常規(guī)地用于改良異花授粉植物的育種程序的全面評(píng)論提供于許多文本和文章中，包 括：阿拉德（Allard),植物育種原理（Principles of Plant Breeding),約翰?威利父子 公司（John Wiley&Sons, Inc.) (1960);西蒙茲（Simmonds),作物改良原理（Principles of Crop Improvement),朗曼有限公司（Longman Group Limited) (1979);哈勞爾（Hallauer) 和米蘭達(dá)（Miranda),玉米數(shù)量遺傳學(xué)（Quantitative Genetics in Maize Breeding),愛 荷華州立大學(xué)出版社（Iowa State University Press) (1981);和延森（Jensen),植物育 種方法（Plant Breeding Methodology),約翰·威利父子公司（1988)。
[0104] 混合詵擇.在混合選擇中，在不進(jìn)行后代測試的情況下選擇所需個(gè)體植物、收獲 并且將種子混合以產(chǎn)生下一代。由于選擇是僅基于母本的，并且不控制授粉作用，混合選擇 相當(dāng)于一種形式的隨機(jī)交配與選擇。如本文中所陳述，混合選擇的目的為增加群體中優(yōu)良 基因型的比例。
[0105] 合成物.通過在所有可能的雜種組合中選擇良好配合力的多種基因型彼此之間 的雜交產(chǎn)生合成品種，隨后通過自由授粉作用維持品種。無論親本為（或多或少近交）種 子繁殖品系，如在一些甜菜和菜豆（野豌豆屬）中，或克隆體，如在禾本科牧草、三葉草和苜 蓿中，基本上沒有區(qū)別。親本按一般配合力，有時(shí)通過測交或頂交，更一般化地通過多系雜 交選擇。親本種子品系可能有意地近交（例如通過自交或近親雜交）。但是，即使親本未有 意地近交，在品系維持期間在品系內(nèi)的選擇將確保出現(xiàn)一些近親配種。當(dāng)然，克隆親本將保 持不變和高度異型接合。
[0106] 合成可以直接從親本種子隔離區(qū)到達(dá)農(nóng)戶或必須首先經(jīng)歷一個(gè)或兩個(gè)循環(huán)的倍 增取決于種子產(chǎn)量和種子的需求規(guī)模。在實(shí)踐中，禾草和三葉草一般倍增一次或兩次并且 因此從初始合成顯著去除。
[0107] 盡管有時(shí)使用混合選擇，但對(duì)于多系雜交，后代測試由于其操作簡單性和與目標(biāo) (即在合成中采用一般配合力）的明顯相關(guān)性而一般為優(yōu)選的。
[0108] 進(jìn)入合成物的親本品系或克隆體的數(shù)目大幅變化。在實(shí)踐中，親本品系的數(shù)目在 10到數(shù)百范圍內(nèi)，平均值為100-200。由100個(gè)或更多個(gè)克隆體形成的廣基合成物將預(yù)期 比窄基合成物于在種子繁殖期間更穩(wěn)定。
[0109] 純血種品種.純血種品種為產(chǎn)牛自在分隔群體中詵擇個(gè)體植物,接著講行自授粉 后代的傳播和種子繁殖以及經(jīng)若干代的基因型的謹(jǐn)慎測試的優(yōu)良基因型。此為在自然自授 粉物種的情況下作用良好的自由授粉方法。此方法可以與混合選擇組合用于品種發(fā)展中。 譜系和質(zhì)量選擇相組合的變化為在自授粉作物中產(chǎn)生品種的最常用方法。
[0110] 雜種.雜種為由不同基因型的親本之間的雜交產(chǎn)生的個(gè)體植物。商品雜種在充分 地用于許多作物，包括玉米（corn/maize)、高粱、甜菜、葵花和椰菜中。雜種可以多種不同方 式形成，包括直接通過兩個(gè)親本的雜交（單交種）、通過單交種與另一親本的雜交（三交種 (three-way/triple cross hybrid))或通過兩個(gè)不同雜種的雜交（四交或雙雜交種）。
[0111] 嚴(yán)格來說，異交（即自由授粉）群體中的大部分個(gè)體為雜種，但所述術(shù)語對(duì)于親本 為基因組足夠不同以將其識(shí)別為不同種或亞種的個(gè)體的情況通常為例外的。取決于兩個(gè)親 本的基因組中的定性和/或定量差異，雜種可能是可育的或不育的。雜種優(yōu)勢（Heterosis/ hybrid vigor)通常與使得雜種的生長勢、存活率和生育力相比于用于形成所述雜種的親 本品系增加的增加的異型接合性相關(guān)。最大雜種優(yōu)勢通常通過雜交兩個(gè)基因不同、高度近 交的品系實(shí)現(xiàn)。
[0112] 生產(chǎn)雜種為發(fā)展良好的行業(yè)，涉及分開生產(chǎn)親本品系和由雜交那些品系產(chǎn)生 的雜種。關(guān)于雜種生產(chǎn)方法的詳細(xì)論述，參見例如賴特（Wright)商業(yè)雜種種子生產(chǎn) (Commercial Hybrid Seed Production) 8:161-176,作物植物雜交（Hybridization of Crop Plants)中。
[0113] 本發(fā)明通過以下實(shí)例進(jìn)一步說明，所述實(shí)例不應(yīng)理解為限制性的。在本申請(qǐng)案通 篇以及圖式和序列表中所引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公開專利申請(qǐng)案的內(nèi)容以引用的方 式并入本文中。
[0114] 實(shí)例
[0115] 實(shí)例I :使經(jīng)受田間應(yīng)力塊莖中的糖端發(fā)生率最小化的轉(zhuǎn)化酶沉默
[0116] 使用兩個(gè)引物對(duì)（SEQ ID ΝΟ:1 和SEQ ID NO:19 ;SEQ ID NO:2和SEQ ID N0:20)自 馬鈴薯品種褐色'游俠'的塊莖聚（A)+mRNA衍生庫擴(kuò)增Inv基因（基因庫登錄號(hào)DQ478950) 的cDNA的有義和反義片段。擴(kuò)增片段分別對(duì)應(yīng)于Inv基因的位置+53至+733 (有義）和 +552至+49 (反義）。下至轉(zhuǎn)化酶cDNA的21-23個(gè)堿基對(duì)的任何片段可以用于使Inv基 因 （SEQ ID NO: 5)沉默。克隆的片段以反向重復(fù)序列（SEQ ID NO: 3和4)形式安置在來自 馬鈴薯品種褐色'游俠'的調(diào)節(jié)元件：ADP葡萄糖焦磷酸酶（Agp)基因（登錄號(hào)HM363752， SEQ ID N0:6)的2.2kb塊莖特異性啟動(dòng)子與泛素-3基因（登錄號(hào)GP755544，SEQ ID N0:7) 的0. 3kb終止子之間。將所得沉默盒插入還攜帶有用于選擇性標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (npt)基因的表達(dá)盒的pSM401衍生T-DNA區(qū)中（羅門斯（Rommens)等人，植物生理學(xué) 139:1338-13492005)產(chǎn)生載體 pSIM1632。
[0117] 使含有pSM1632Inv沉默載體的農(nóng)桿菌在28°C下在含有抗生素的LB培養(yǎng)基 (20g/LLB培養(yǎng)液，西格馬（Sigma))中生長過夜以針對(duì)細(xì)菌和載體進(jìn)行選擇。使過夜培養(yǎng) 物的十倍稀釋液生長5-6小時(shí)至對(duì)數(shù)期并且在3000rpm下沉淀。在補(bǔ)充有3%蔗糖的M404 液體培養(yǎng)基（發(fā)朵技術(shù)（PhytoTechnology),堪薩斯州肖尼（Shawnee, KS)中洗絳集結(jié)粒并 且再懸浮于相同液體培養(yǎng)基中以獲得〇D_為0. 2的細(xì)胞密度。
[0118] 用于外植體材料的儲(chǔ)備植物維持于具有40ml含有3%蔗糖和2g/L結(jié)冷膠，pH 5. 7 的半強(qiáng)度M516培養(yǎng)基（發(fā)朵技術(shù)，堪薩斯州肖尼）的洋紅盒中。自4周齡植物切割4-6_ 的馬鈴薯節(jié)間片段，經(jīng)農(nóng)桿菌感染并且轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有3%蔗糖和6g/L瓊脂，pH 5. 7的M404 培養(yǎng)基中。在2天共培養(yǎng)之后，將外植體放置在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基為M404培養(yǎng) 基加上3%蔗糖、2. 5mg/L玉米素核糖苷、0· lmg/L NAA、6g/L瓊脂，ρΗ5· 7和150mg/L消除農(nóng) 桿菌的特美?。╰imentin)和100mg/L作為選拔劑的卡那霉素（kanamycin)。在位于愈傷誘 導(dǎo)培養(yǎng)基上一個(gè)月之后，將外植體移動(dòng)到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（M404培養(yǎng)基加上3%蔗糖、2. 5mg/ L玉米素核糖苷、0.3mg/L GA3、6g/L瓊脂，pH 5.7、150mg/L特美汀和100mg/L卡那霉素）直 到獲得芽。芽在M404培養(yǎng)基加上3%蔗糖、膠凝劑和100mg/L卡那霉素上生根。經(jīng)由PCR 對(duì)卡那霉素存在下的芽生根進(jìn)行關(guān)于存在轉(zhuǎn)基因的篩選。Northern分析證實(shí)選擇用于ZC 實(shí)驗(yàn)的品系中的Inv基因的沉默（圖5A)。對(duì)于相關(guān)基因沉默的品系經(jīng)體外傳播并且在溫 室中生長以用于種子生產(chǎn)。<