一種日本乙型腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技術(shù)的日本乙型腦炎病毒快速檢測(cè)技術(shù)。具 體涉及日本乙型腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，以及所述試劑盒中使用的對(duì) 于乙型腦炎NSl基因具有特異性的引物對(duì)和分子信標(biāo)探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)屬于黃病毒科黃病毒 屬，是一種危害嚴(yán)重的人畜共患病病原。該病毒為單股正鏈RNA病毒，其核酸序列編碼了 3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural protein)，其中各基因型間NSl蛋白的同源 性較高，是建立該病核酸檢測(cè)的良好候選基因。日本乙型腦炎經(jīng)蚊傳播，多見(jiàn)于夏秋季，對(duì) 患者神經(jīng)系統(tǒng)的造成不可逆的損傷，病死率高，部分幸存者會(huì)遺留中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。我 國(guó)為日本乙型腦炎高發(fā)區(qū)，平均年發(fā)病數(shù)約占全世界乙腦發(fā)病數(shù)的80%，且主要危害人群 為兒童，對(duì)人民的健康造成極大的危害。因此建立一套簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)的日本乙型腦炎 病毒檢測(cè)技術(shù)，對(duì)該病的防控和臨床診有著十分重要的意義。
[0003] 由于乙腦的流行具有明顯的季節(jié)性、地區(qū)性和臨床病變，可以據(jù)其進(jìn)行初步診斷， 但確診還是需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷，主要包括病毒的分離鑒定、酶聯(lián)免疫法和RT-PCR等。病 毒分離培養(yǎng)法操作繁瑣，耗時(shí)很長(zhǎng)，不適于快速檢測(cè)和臨床緊急病情處理；酶聯(lián)免疫檢測(cè) 技術(shù)受其本身的限制，靈敏度比較低，不利于病程初期的診斷；RT-PCR、熒光RT-PCR以及 RT-LAMP等也是基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法，靈敏度較前兩種方法提高了很多，但PCR的擴(kuò)增 需要有反轉(zhuǎn)錄步驟以及變性、退火及延伸等多個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行幾十次升降溫循環(huán)，耗時(shí)較長(zhǎng)， 而LAMP方法對(duì)引物設(shè)計(jì)區(qū)域要求過(guò)高，在變異較大且頻繁的RNA病毒上難以實(shí)現(xiàn)良好應(yīng) 用。
[0004] 核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增（NASBA)與以往核酸擴(kuò)增技術(shù)不同，更為高效簡(jiǎn)便，尤其 適用于RNA病毒的檢測(cè)。NASBA在A(yíng)MV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶、RNA酶H的介導(dǎo)下，在 41°C -42°C恒溫條件下，經(jīng)一對(duì)引物在體外連續(xù)擴(kuò)增出均一的特異性的核酸序列。在該技 術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合分子信標(biāo)探針（moleular beacon)可以建立實(shí)時(shí)焚光NASBA (Real-time NASBA)擴(kuò)增技術(shù)。Real-time NASBA具有以下特點(diǎn)：①在同一溫度條件下進(jìn)行的等溫?cái)U(kuò)增； ②與RT-PCR相比，無(wú)需15-30分鐘的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，不受引物量限制，在60-90分鐘內(nèi)使模板 RNA擴(kuò)增IO9倍以上，靈敏度甚至可以達(dá)到檢測(cè)拷貝數(shù)為個(gè)位的模板RNA ;③只對(duì)RNA模板 進(jìn)行擴(kuò)增，不受雙鏈DNA污染的影響，且產(chǎn)物通過(guò)分子信標(biāo)探針來(lái)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)檢測(cè)并 減少了對(duì)環(huán)境的污染。④與RT-LAMP相比，更容易篩選出檢測(cè)靶位點(diǎn)，滿(mǎn)足變異度高的核酸 病毒檢測(cè)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種基于實(shí)時(shí)熒光核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增技術(shù)（Real-time NASBA)對(duì)日本乙型腦炎NSl基因具有特異性檢測(cè)作用的引物對(duì)和分子信標(biāo)探針；此外，本 發(fā)明還提供了一種包含上述引物對(duì)和分子信標(biāo)的日本乙型腦炎R(shí)eal-time NASBA檢測(cè)試劑 盒。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)研宄并不懈努力，最終獲得了如下 技術(shù)方案：
[0007] -種用于實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的特異性引物對(duì)，該引物對(duì) 包括正向引物Primer-I和反向引物Primer-2,所述正向引物和反向引物的堿基序列如下 所示：
[0008] Primer-I :5, -GACGTTAGCAGGTAGACGAGGCATGATGAAACAACACTC-3,（SEQ ID NO :1);
[0009] Primer-2 :5' -CTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCTCTTGCGAAGGAC-3'（SEQ ID NO : 2) 〇
[0010] 一種用于實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的分子信標(biāo)探針Tagl，該 分子信標(biāo)探針在其寡核苷酸DNA分子的5'端標(biāo)記焚光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記促滅基團(tuán) DABCYL，探針上的寡核苷酸DNA分子的堿基序列如SEQ ID NO :3所示。整個(gè)探針形式如下 所示：
[0011] 5 ' FAM-CATCGCAGCTGGGCCTTCTGGTGATGTTTCTCGATG-DABCYL-3 '。
[0012] 由于上述特異性引物對(duì)和分子信標(biāo)探針可用來(lái)檢測(cè)離體標(biāo)本中是否存在乙型腦 炎病毒的NSl基因，進(jìn)而確定樣品中是否含有乙型腦炎病毒，因此本發(fā)明還提供一種產(chǎn)品 新用途，即：上述的特異性引物對(duì)在制備診斷或檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑中的用途； 或者，上述的分子信標(biāo)探針在制備診斷或檢測(cè)日本乙型腦炎病毒的試劑中的用途。
[0013] 本發(fā)明提供的一種日本乙型腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒至少包括： 2 X實(shí)時(shí)熒光NASBA反應(yīng)液和4 X酶混合液。所述2 X實(shí)時(shí)熒光NASBA反應(yīng)液包含有如上 所述的正向引物Primer-Ι、反向引物Primer-2和分子信標(biāo)探針；4X酶混合液包AMV反轉(zhuǎn) 錄酶、T7RNA聚合酶和RNase H酶等。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述2X實(shí)時(shí)熒光NASBA反應(yīng)液各組分見(jiàn)表1，4X酶混合液各組分 見(jiàn)表2。
[0015] 表1 :2 X實(shí)時(shí)熒光NASBA反應(yīng)液
[0016]
[0019] 所述的日本乙型腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì) 照和空白對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為乙型腦炎體外轉(zhuǎn)錄NSl基因的RNA片段，所述陰性對(duì)照為在 核酸提取時(shí)與標(biāo)本同時(shí)平行提取無(wú)菌生理鹽水，所述空白對(duì)照為無(wú)核酸酶的超純水。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次通過(guò)提供一種對(duì)乙型腦炎病毒NSl基因具有特異性 的一對(duì)引物和一條分子信標(biāo)探針，包含上述引物對(duì)和分子信標(biāo)探針的試劑盒，來(lái)檢測(cè)離體 標(biāo)本中是否存在乙型腦炎病毒的NSl基因，進(jìn)而確定樣品中是否含有乙型腦炎病毒；本發(fā) 明在設(shè)計(jì)篩選擴(kuò)增引物時(shí)，以乙腦病毒檢測(cè)的特異性和通用性為本，綜合考慮引物和探針 的Tm值、3 '末端自由能，GC含量、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、Λ G等因素，并分析比較了日本乙型腦炎病 毒5個(gè)不同基因型毒株的基因序列，所設(shè)計(jì)篩選的引物可對(duì)不同基因型NSl進(jìn)行檢測(cè)。另 外，本發(fā)明所涉及的檢測(cè)試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 1、等溫?cái)U(kuò)增：避免了普通RT-PCR對(duì)溫度循環(huán)的特殊要求所帶來(lái)的種種不便；
[0022] 2、特異：通過(guò)精心設(shè)計(jì)并結(jié)合臨床樣本篩查優(yōu)化選擇出的特異性正向引物、反向 引物和分子信標(biāo)探針，同步識(shí)別乙型腦炎病毒的3個(gè)不同區(qū)域，保證了擴(kuò)增的特異性；
[0023] 3、靈敏：由于NASBA自身的擴(kuò)增特點(diǎn)，使得檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高，拷貝數(shù)為個(gè)位 的模板可被檢出；
[0024] 4、高效：可以在60-90分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，并使模板RNA擴(kuò)增約IO9倍；
[0025] 5、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：NASBA擴(kuò)增結(jié)束后馬上可以分析數(shù)據(jù)獲得檢測(cè)結(jié)果，無(wú)需再次操作 減少對(duì)環(huán)境的污染。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖 I :NASBA 的 AMV buffer 體積的優(yōu)化，其中，1 :2· 4 μ L ;2 :2· 8 μ L ;3 :3· 2 μ L ;4 : 3. 6 μ L ;5 :4. 0 μ L ;6 :4· 4 μ L ;7 :4· 8 μ L。
[0027] 圖 2 :NASBA 的 dNTP/NTP 濃度的優(yōu)化，其中，1 :0· 5mM/2mM ;2 :lmM/2mM，3 : I. 5mM/2mM ;4 :2mM/2mM。
[0028] 圖 3 :NASBA 引物濃度的優(yōu)化，其中，1 :0· 125mM ;2 :0· 25mM ;3 :0· 375mM ;4 :0· 5mM ; 5 :0. 625mM ;6 :陰性對(duì)照；7 :空白對(duì)照。
[0029] 圖 4 :NASBA 反應(yīng)探針濃度的優(yōu)化，其中，I :0. 5mM ;2 :0. 375mM ;3 :0. 25mM ;4 : 0. 125mM。
[0030] 圖 5 :NASBA 反應(yīng)的 DMSO 濃度的優(yōu)化，其中，1:4% ;2:6% ;3 :8% ;4:10% ;5:12% ; 6 :陰性對(duì)照。
[0031] 圖 6 :乙型腦炎 Real-Time NASBA靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，I :1. 5X109copy/yL ;2 : 1. 5X IO8Copy/ μ L ；3 ：I. 5 X IO7Copy/ μ L ；4 ：I. 5 X IO6Copy/ μ L ；5 ：I. 5 X IO5Copy/ μ L ；6 ： I. 5Χ IO4Copy/ μ L ；7 ：1. 5Χ IO3Copy/ μ L ；8 ：1. 5Χ IO2Copy/ μ L ；9 ：1. 5Χ IO1Copy/ μ L ；10 ： I. 5copy/ μ L ;11 :1· 5Χ 10 1Copy/ μ L ;12 :陰性對(duì)照。
[0032] 圖 7 :RT-PCR 靈敏度實(shí)驗(yàn)電泳圖，其中，M :marker2000 ;1 :1. 5X109copy/yL ;2 : I. 5X IO8Copy/ μ L ；3 ：I. 5 X IO7Copy/ μ L ；4 ：I. 5 X IO6Copy/ μ L ；5 ：I. 5 X IO5Copy/ μ L ；6 ： I. 5Χ IO4Copy/ μ L ；7 ：1. 5Χ IO3Copy/ μ L ；8 ：1. 5Χ IO2Copy/ μ L ；9 ：1. 5Χ IO1Copy/ μ L ；10 ： I. 5copy/yL ;11 :1. SXK^copy/yL ;NTC 為陰性對(duì)照。
[0033] 圖8 :Real time-NASBA特異性實(shí)驗(yàn)，其中，1 :豬瘟病毒；2 :乙腦病毒；3 :繁殖與呼 吸系統(tǒng)綜合征病毒；4 :流行性腹瀉病毒；5 :陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面提供具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果，但本發(fā)明的保護(hù) 范圍不限于如下實(shí)施例。
[0035] 實(shí)施例1、陽(yáng)性對(duì)照品的制備
[0036] 從日本乙型腦炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中用超離的方式提純收獲病毒顆粒，提取病毒 RNA。設(shè)計(jì)NSl基因擴(kuò)增引物N-Primer-I和N-Primer-2,利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得約520bp 的日本乙型腦炎NSl基因片段。將獲得的RT-PCR產(chǎn)物插入pGEM-4z克隆質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì) 粒pGEM-4z-NSl，并進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與GenBank中隨機(jī)選擇的10條5種不同基因 型的日本乙型腦炎病毒NSl基因序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，保證其同源性達(dá)到95%以上。陽(yáng) 性克隆菌株增菌后提取質(zhì)粒DNA，線(xiàn)性化后，利用質(zhì)粒上的T7啟動(dòng)子，對(duì)插入的NSl基因進(jìn) 行體外轉(zhuǎn)錄，獲得NSl的單鏈RNA。轉(zhuǎn)錄后用DNase I消化去除其中的DNA分子，然后利用 全式金公司的試劑盒Easypure RNA Purification kit進(jìn)行過(guò)柱純化。利用微量紫外分光 光度計(jì)測(cè)定純化后RNA的濃度，通過(guò)其分子量計(jì)算出拷貝數(shù)。分裝后于-80°C保存，作為試 劑盒的陽(yáng)性對(duì)照。
[0037] 上述引物序列為：
[0038] N-Primer-I:GCTCTAGAGCACTCATCATTCCGCATACCAT
[0039] N-Primer-2:CGGAATTCCGCATACCTCGCCAAATCAGTGT
[0040] 實(shí)施例2、日本乙型腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光NASBA檢測(cè)體系的建立與優(yōu)化 [0041] 針對(duì)影響實(shí)時(shí)熒