一種基于snp標(biāo)記的黃瓜品種鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)的蔬菜育種與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及黃瓜品種真實(shí)性鑒定的檢 測(cè)方法，是一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)黃瓜的12個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜是人民日常生活中十大蔬菜品種之一，因其獨(dú)特的風(fēng)味和口感深受廣大消費(fèi) 者喜愛，產(chǎn)品銷售時(shí)間長(zhǎng)，品種種植地域廣。我國黃瓜種業(yè)一直領(lǐng)先世界，特別是天津科潤 黃瓜研究所培育的"津優(yōu)"、"津美"號(hào)等黃瓜品種是天津市支柱型種子品牌，遠(yuǎn)銷30個(gè)省、 市、自治區(qū)，已覆蓋全國黃瓜露地栽培面積的60%以上，在市場(chǎng)占有率明顯高于先正達(dá)等國 際種子公司。
[0003] 伴隨著我國黃瓜種業(yè)的優(yōu)勢(shì)發(fā)展，市場(chǎng)上出現(xiàn)了一些套牌品種，以次充好，影響了 種植戶的產(chǎn)量和收入；甚至人非法盜取育種材料進(jìn)行繁種，嚴(yán)重影響了我國育種單位的利 益及我國黃瓜種業(yè)的健康發(fā)展，因此，亟需建立一種精準(zhǔn)、高通量、高自動(dòng)化的黃瓜種子品 種鑒定和純度檢測(cè)技術(shù)體系，服務(wù)于種子執(zhí)法單位的監(jiān)管檢測(cè)及育種單位種子質(zhì)量?jī)?nèi)部控 制，而其中，多態(tài)性強(qiáng)、密度高、遺傳穩(wěn)定的分子標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建及配套高通量、高自動(dòng) 化的檢測(cè)模式是檢測(cè)技術(shù)體系的關(guān)鍵。常規(guī)的標(biāo)記技術(shù)如形態(tài)特征標(biāo)記、同工酶標(biāo)記、RAPD 標(biāo)記、SSR標(biāo)記等技術(shù)具有標(biāo)記密度不足、操作復(fù)雜、不能自動(dòng)化分析差等缺點(diǎn)，不能滿足市 場(chǎng)的要求。
[0004] 本專利立足我國黃瓜育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展，結(jié)合生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技 術(shù)，篩選、確認(rèn)黃瓜SNP位點(diǎn)，確定黃瓜品種鑒定核心SNP位點(diǎn)，建立精確、快速、高通量和高 度自動(dòng)化的基于SNP標(biāo)記的黃瓜品種鑒定技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)，為保護(hù)我國黃瓜育種單位產(chǎn) 權(quán)利益，維護(hù)我國黃瓜育種產(chǎn)業(yè)健康、快速發(fā)展提供技術(shù)支撐，對(duì)規(guī)范、監(jiān)管種子市場(chǎng)、保護(hù) 種植戶的產(chǎn)量和收入具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于公開了一種基于SNP標(biāo)記的黃瓜品種真實(shí)性鑒定方法，為實(shí)現(xiàn) 上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：
[0006]用于黃瓜品種真實(shí)性鑒定的12個(gè)SNP位點(diǎn)，以及用于檢測(cè)該12個(gè)位點(diǎn)的12套引 物，其特征在于：
[0007]
【主權(quán)項(xiàng)】
注；"Biotin-"代表該引物在5'端加上生物素標(biāo)記修飾。
2. -種采用權(quán)利要求1所述的12套特異性引物，使用PCR-焦磯酸測(cè)序方法，鑒定黃瓜 品種真實(shí)性的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 采用權(quán)利要求1中所述的12套引物中的PCR引物（-F和-R)及GoTaq⑩Master Mix,分別加入供試品種和對(duì)照品種的DM模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為： 總體積為 5〇yL，其中；2xG〇Taq?Mas化r Mix25|_山，lOymol/L引物各lyL，DNA模板 2yL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至50yL;反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性lOmin，94°C變性30S，5(TC退 火30S，72°C延伸45S，循環(huán)50次，最后72°C延伸7min，4°C保存； (2) 采用權(quán)利要求1所述的焦磯酸測(cè)序特異性引物（-S)，分別對(duì)供試品種和對(duì)照品種 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磯酸測(cè)序分析；50yLPCR產(chǎn)物中加入47yLBindingbuffer和 3]iLSe地arosebeads, 1300巧m潤旋混勻 15min,經(jīng)Vacuumpr巧workstation單鏈分離， 釋放到預(yù)先加入38. 8yLAnnealingbuffer和1. 2yL測(cè)序引物的PSQ96測(cè)序反應(yīng)板中， 8(TC金屬加熱塊上放置2min后冷卻至室溫；將酶、底物和A、T、C、G成分加入試劑倉，即可 上機(jī)測(cè)序。 (3) 測(cè)序時(shí)間8~lOmin，測(cè)序結(jié)束后使用"SNP"模式對(duì)12個(gè)黃瓜SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型分 析，比較供試品種和對(duì)照品種在12個(gè)SNP位點(diǎn)上的分型情況，全部相同為同一品種，否則， 為不同品種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的黃瓜品種鑒定的方法。該方法是利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)黃瓜的12個(gè)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行分型分析，以達(dá)到對(duì)黃瓜品種進(jìn)行真實(shí)性鑒定的結(jié)果。本發(fā)明的檢測(cè)方法在5h之內(nèi)即可完成黃瓜品種真實(shí)性鑒定工作，具有穩(wěn)定、高通量、精準(zhǔn)的等特點(diǎn)。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104846062
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410052299
【發(fā)明人】蘭青闊, 王永, 趙新, 李歐靜, 朱珠, 陳銳
【申請(qǐng)人】天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2014年2月17日