具有產(chǎn)麥芽糖特性的淀粉酶的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2012年11月20日提交的國際專利申請No. PCT/ CN2012/084883的權(quán)益，該專利申請的內(nèi)容據(jù)此全文以引用方式并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了與新型產(chǎn)麥芽糖淀粉酶相關(guān)的組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 淀粉是直鏈淀粉（15-30 %重量/重量）和支鏈淀粉（70-85 %重量/重量）的混 合物。直鏈淀粉由分子量（MW)為約60, 000至約800, 000的α -1，4-連接的葡萄糖單元的 直鏈組成。支鏈淀粉是每24-30個葡萄糖單元含有α -1，6分支點的支鏈聚合物；其MW可 高達一億。
[0005] 濃縮右旋糖漿形式的得自淀粉的糖目前通過酶催化法制備，該方法涉及：（1)用 α -淀粉酶將固體淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度為約7-10的糊精，以及（2)用淀 粉葡糖苷酶（也稱為葡糖淀粉酶或GA)將所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖化。所得的 糖漿具有高葡萄糖含量。大部分商業(yè)生產(chǎn)的葡萄糖漿隨后通過酶法異構(gòu)化為稱為異糖漿 (isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖漿也可用微生物（諸如酵母）發(fā)酵以產(chǎn)生商 品，包括例如乙醇、梓檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸鹽、賴氨酸、其他有機 酸、其他氨基酸和其他生物化學(xué)品?？赏瑫r進行發(fā)酵和糖化（即SSF工藝）來實現(xiàn)更大的 經(jīng)濟性和效率。
[0006] α-淀粉酶通過隨機裂解內(nèi)部的α-l，4-糖苷鍵來水解淀粉、糖原和相關(guān)多糖。 α_淀粉酶（特別是來自芽孢桿菌屬（Bacilli)的α-淀粉酶）已被用于各種不同的用途， 包括淀粉液化和糖化、紡織物退漿、造紙和紙漿工業(yè)中的淀粉改性、釀造、烘焙、用于食品工 業(yè)的糖漿的生產(chǎn)、用于發(fā)酵工藝的原料的生產(chǎn)，以及在動物飼料中用于提高消化性。這些酶 也可用于在盤碟洗滌和衣物洗滌過程中除去含淀粉污垢和污漬。
[0007] 麥芽糖是由β-1，4'-糖苷鍵連接的兩種D-吡喃葡萄糖構(gòu)成的二糖，其在食品/ 冷凍食品、烘焙、釀造和飲料工業(yè)的應(yīng)用方面具有高商業(yè)價值。麥芽糖也是用于制備無熱量 糖甜味劑麥芽糖醇的底物。高純度麥芽糖或純麥芽糖是用于糖尿病患者的靜脈注射液的活 性組分。用于制備含有不同水平麥芽糖含量（即，〈50%麥芽糖（高轉(zhuǎn)化糖漿或低麥芽糖糖 漿）、50-55%麥芽糖（高麥芽糖糖漿）、70-75%麥芽糖（非常高麥芽糖）和>80%麥芽糖 (超高麥芽糖））的糖漿的商業(yè)過程已根據(jù)具體應(yīng)用進行了建立。這些過程的共同因素在 于，均涉及具有兩個不同步驟（即液化和糖化）的雙酶工藝。
[0008] 以往，淀粉的水解涉及兩個酶步驟，以制備葡萄糖糖漿或麥芽糖糖漿。第一個步驟 是在高溫（>95°C)下的液化步驟，而第二個步驟是糖化步驟。在麥芽糖制備中，第二個步 驟被稱為麥芽糖糖化并且通常在60°C或60°C以下的溫度下發(fā)生。在液化步驟中，通常在 存在添加的鈣的情況下，將不溶性淀粉顆粒在水中漿化，經(jīng)加熱糊化，并由來自芽孢桿菌屬 物種的熱穩(wěn)定性α -淀粉酶（EC. 3. 2. I. 1，α -1，4' -D-葡聚糖葡聚糖水解酶）水解。來自 地衣芽抱桿菌（Bacillus Iicheniformis)(例如，得自杜邦-杰能科（DuPont-Genencor) 的SPEZYME? frED或得自諾維信公司（Novozymes)的Termamyl?L-l2〇)、嗜熱脂肪 芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus)(例如，得自杜邦-杰能科的SPEZYME& XTRA、得自諾維信公司的Termamyr' SC和TermamylK' SUPRA)或地衣芽孢桿菌和嗜熱 脂肪芽孢桿菌的共混物（例如，得自杜邦-杰能科的ClearfIowtmAA或得自諾維信公司的 Liqu〇zymeK Supra)的細(xì)菌衍生的熱穩(wěn)定性α-淀粉酶首先用于在高溫（>95°C)、pH 5. 2-6. 5下將淀粉液化為低DE(右旋糖當(dāng)量）的可溶性淀粉水解物。在麥芽糖糖化步驟中， 通常在低得多的溫度下使用產(chǎn)麥芽糖酶，諸如真菌α-淀粉酶（例如，得自杜邦-杰能科的 CLARASE? L或得自諾維信公司的Fungamyl? 800L)、植物β -淀粉酶（例如，得自杜 邦-杰能科的OPTIMALT? BBA或得自Senson公司的BetalaSel500L)，以進一步水解可 溶性淀粉水解物。對于含有多于60%麥芽糖的麥芽糖糖漿，在液化淀粉的麥芽糖糖化過程 中添加諸如支鏈淀粉酶之類的脫支酶（例如，得自杜邦-杰能科的OPTTMAX x L-1000、 得自諾維信公司的Promozyme? D2或得自諾維信公司的Promozyme? D6)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了一種分離的核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的簡并變體的核苷酸序列。
[0010] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了一種分離的核酸，該核酸包含編碼由 SEQ ID N0:3的氨基酸序列組成的多肽的序列。
[0011] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了一種分離的核酸，該核酸包含在嚴(yán)格 條件下與雜交探針雜交的序列，該雜交探針的核苷酸序列由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1 的互補序列組成。
[0012] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了一種分離的核酸，該核酸包含與SEQ ID N0:1 至少 66 %、67 %、68 %、69 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、98 %、99 % 或 99. 5%同一的序列。在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了這樣的分離的核酸，其中該 核酸編碼具有淀粉水解活性的多肽。
[0013] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了一種分離的核酸，該核酸包含編碼與 SEQ ID N0:3 至少 66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或 99. 5%同一的多肽的序列，其中所述多肽具有淀粉水解活性。
[0014] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了一種分離的核酸，該核酸包含編碼包 含以下的序列的多肽的序列：SEQ ID N0:3或者具有最多至50個保守氨基酸置換的SEQ ID NO: 3,其中所述多肽具有淀粉水解活性。
[0015] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了純化的多肽，其氨基酸序列包含與 SEQ ID N0:3 至少 66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或 99. 5%同一的序列。
[0016] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了包含SEQ ID NO: 3但是具有0至20個 保守氨基酸置換的氨基酸序列的純化多肽。
[0017] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了包含有效連接至表達控制序列的權(quán)利 要求1-6中任一項所述的核酸序列的表達載體。在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供 了包含這種載體的培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了包含有效連接至 表達控制序列的本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的任何核酸的培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo) 內(nèi)容提供了用由本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容提供的任何載體轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞或所述細(xì)胞的子代，其中 所述細(xì)胞表達核酸以形成多肽。
[0018] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了制備蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在允 許表達多肽的條件下培養(yǎng)由本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容提供的細(xì)胞。
[0019] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了使用本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的多肽的方法， 該方法包括在以下任一項中包括所述多肽：淀粉液化、淀粉糖化、紡織物退漿、造紙和紙漿 工業(yè)中的淀粉改性、釀造、烘焙、用于食品工業(yè)的糖漿的生產(chǎn)、用于發(fā)酵工藝的原料的生產(chǎn)、 動物飼料、以及在盤碟洗滌和/或衣物洗滌過程中除去含淀粉污垢和/或污漬。
[0020] 在一些實施例中，本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容提供了包含本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的多肽以及至少 一種輔助酶的組合物，所述輔助酶選自植酸酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、β淀粉酶、異淀粉酶、 不同的淀粉酶、α-葡糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶、半纖維素酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)移酶、果 膠酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、酯酶、膽堿氧化酶、過氧化物酶/氧化酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖 酶、角質(zhì)酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、?；D(zhuǎn)移酶、過水解酶、芳基酯酶、以及氧化還原酶。
[0021] 通過本發(fā)明的描述和附圖，本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的組合物和方法的這些方面和其他方 面以及實施例將顯而易見。
【附圖說明】
[0022] 圖1分圖A和分圖B示出了根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的一些實施例的一些示例性數(shù) 據(jù)。
[0023] 圖2分圖A和分圖B示出了根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的一些實施例的一些示例性數(shù) 據(jù)。
[0024] 圖3示出了根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的一些實施例的一些示例性數(shù)據(jù)。
[0025] 圖4示出了根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的一些實施例的一些示例性數(shù)據(jù)。
[0026] 圖5示出了根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的一些實施例的一些示例性數(shù)據(jù)。
[0027] 圖6示出了根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的一些實施例的一些示例性數(shù)據(jù)。
[0028] 圖7示出了根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的一些實施例的一些示例性數(shù)據(jù)。
[0029] 圖8示出了根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的一些實施例的一些示例性數(shù)據(jù)。
[0030] 圖9示出了根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的一些實施例的示例性克隆圖譜。
[0031] 序列的簡要說明
[0032] SEQ ID NO: 1示出AmyMG的全長核苷酸序列。
[0033] SEQ ID NO:2示出AmyMG的天然信號序列的核苷酸序列。
[0034] SEQ ID NO:3示出AmyMG的全長氨基酸序列。
[0035]