一種六次甲基四胺完全抗原的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品安全檢測領(lǐng)域，具體地說是一種六次甲基四胺完全抗原的制備方法及其該完全抗原在六次甲基四胺檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]六次甲基四胺(俗名烏洛托品)，分子式C6H12N4，屬化工原料，被衛(wèi)生部列入第五批《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》中，六次甲基四胺被禁止添加到食品當(dāng)中或在加工食品過程中使用。部分違法者將其摻入腐竹、粉絲、水產(chǎn)品等食品中，會起到增白、保鮮、增加口感、防腐的效果。六次甲基四胺本身屬低毒類，可作為藥物服用。但其在酸性條件下，能分解出甲醛，甲醛易與體內(nèi)多種化學(xué)結(jié)構(gòu)的受體發(fā)生反應(yīng)，如與氨基化合物可以發(fā)生縮合，與巰基化合物加成，使蛋白質(zhì)變性。甲醛在體內(nèi)還可還原為醇，故可表現(xiàn)出甲醇的毒理作用，對人體的腎、肝、中樞神經(jīng)、免疫功能、消化系統(tǒng)等均有損害。
[0003]目前，國家標(biāo)準(zhǔn)中還沒有關(guān)于六次甲基四胺的指定檢測方法，一般行業(yè)內(nèi)對其進(jìn)行檢測，主要采用儀器法，比如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MSMS)等。這些方法雖然可以精確地進(jìn)行定量檢測分析，但是存在檢測儀器昂貴、成本高、需要專門的技術(shù)人員來檢測、檢測時間長、方法操作復(fù)雜等缺陷。因此，行業(yè)內(nèi)非常迫切開發(fā)一種簡單、快速、高效檢測六次甲基四胺的方法。
[0004]免疫學(xué)檢測方法是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計的一系列測定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)方法。它可以克服儀器檢測法的上述缺陷，能夠以其簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果直觀、無需儀器等高效地應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域。目前，免疫學(xué)檢測方法中應(yīng)用較廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附測定法，簡稱ELISA法；其基本原理是通過化學(xué)的方法將酶與抗體或抗原結(jié)合起來，形成酶標(biāo)記物；或通過免疫學(xué)的方法將酶與酶抗體結(jié)合起來，形成免疫復(fù)合物，然后通過顯色來檢測。由此可見，為適應(yīng)于食品安全檢測高效、快速特性的迫切需求，行業(yè)內(nèi)開發(fā)一種六次甲基四胺的免疫檢測方法是一個非常不錯的選擇。但是，建立該方法首先需要制備出待測物的高特異性和高敏感性的完全抗原和抗體，而一般針對特定的半抗原需選擇合適的人工抗原合成方法，才能獲得高效價的抗體和理想的檢測效果。到目前為止，國內(nèi)外尚無合成六次甲基四胺完全抗原方法的報道，而采用目前現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)合成人工抗原的方法，如重氮化法、碳二亞胺法、活潑酯法、混合酸酐法等，根本無法合成理想的六次甲基四胺完全抗原。與此同時，目前國內(nèi)外也沒有關(guān)于采用酶聯(lián)免疫法檢測六次甲基四胺的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種六次甲基四胺完全抗原的制備方法，以提供一種高特異性的完全抗原，為其能夠投入到六次甲基四胺酶聯(lián)免疫簡單、快速、有效的檢測應(yīng)用中。
[0006]本發(fā)明的目的之二是利用制備的六次甲基四胺完全抗原及抗體建立一種六次甲基四胺的定量檢測方法。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種六次甲基四胺完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
(A)配制濃度為200-300mg/ml的六次甲基四胺溶液；
(B)配制pH值為7-10、離子濃度為10-1000mmol、含載體蛋白30-50 mg/ml的復(fù)合磷酸鹽緩沖液；所述載體蛋白為牛血清白蛋白；
(C)將所述六次甲基四胺溶液滴加到所述復(fù)合磷酸鹽緩沖液中，再加入體積比濃度為20-25%的戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置1-2小時，4°C靜置過夜；所述六次甲基四胺:復(fù)合磷酸鹽緩沖液:戊二醛水溶液的添加比例為:80-120 mg: l-5ml: 2_3ml ；
(D)將步驟(C)過夜后的混合液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩沖液透析3-5天，每天換液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原。
[0008]所述六次甲基四胺溶液的溶劑為甲醇、乙醇或水中的一種；優(yōu)選甲醇。
[0009]通過實(shí)驗(yàn)證明，采用上述方法制備的六次甲基四胺完全抗原可成功制備高特異性和靈敏性的六次甲基四胺多克隆抗體，完全能夠應(yīng)用于檢測待測物中的六次甲基四胺的含量。
[0010]一種六次甲基四胺的定量檢測方法，包括以下步驟:
(b)利用步驟(a)合成的六次甲基四胺完全抗原進(jìn)行動物免疫，獲得六次甲基四胺多克隆抗血清；
(c)對步驟(a)合成的六次甲基四胺完全抗原進(jìn)行包被，獲得六次甲基四胺包被抗原；
(d)用六次甲基四胺包被抗原包被酶標(biāo)板，封閉，加入不同濃度的六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品，再加入六次甲基四胺多克隆抗血清的稀釋液，設(shè)置以不加入六次甲基四胺為陰性對照，設(shè)置空白對照，洗板，拍干，加入酶標(biāo)二抗，洗板，拍干，加入底物顯色液，終止反應(yīng)，測定酶標(biāo)板上標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照和空白對照的OD49tl值；
(e)根據(jù)步驟(d)測得各孔的OD49tl值，按照公式抑制率=(陰性對照OD值-樣品OD值)/ (陰性對照OD值-空白對照OD值)X100%，計算不同濃度六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的抑制率；
Cf)以六次甲基四胺濃度為橫坐標(biāo)，以所述六次甲基四胺濃度所對應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo)，繪制六次甲基四胺競爭抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線；對所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合，得線性擬合方程；
(g)測定樣品時，先對待測樣品進(jìn)行前處理，按照所述步驟(d)的操作過程，將待測樣品代替六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加樣檢測，測定待測樣品的OD49tl值，按照所述抑制率的計算公式計算所述OD值對應(yīng)的抑制率，將所得的抑制率帶入到所述標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出其所對應(yīng)的六次甲基四胺的含量值或根據(jù)所述線性擬合方程計算出待測樣品中六次甲基四胺的含量。
[0011]本發(fā)明步驟(b)所述六次甲基四胺多克隆抗血清制備的工藝方法為:步驟(b)所述六次甲基四胺多克隆抗血清制備的工藝為:采用初次免疫制劑對兩只雄性大耳白家兔進(jìn)行初次免疫，之后用加強(qiáng)免疫制劑分別于初次免疫后的第2周、4周、8周、12周各加強(qiáng)免疫I次，采用背部皮下脊柱兩側(cè)多點(diǎn)進(jìn)行免疫，于最后一次免疫完第10天，從兔子的耳緣靜脈取血，將血清收集于離心管中，室溫靜置30-35min，待血漿凝聚后，4°C靜置過夜，將血清以3000 r/mim離心15-20 min，得到的上清液為六次甲基四胺多克隆抗血清。
[0012]所述初次免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:4溶于磷酸鹽緩沖液中，得抗原磷酸緩沖液，在抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏完全佐劑，乳化即得；所述加強(qiáng)免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:9溶于磷酸鹽緩沖液中，得加強(qiáng)抗原磷酸緩沖液，在加強(qiáng)抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏不完全佐劑，乳化即得；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.0l mol/L，pH值為7.4。
[0013]本發(fā)明步驟(C)所述六次甲基四胺包被抗原的制備工藝為:步驟(C)所述六次甲基四胺包被抗原的制備工藝為:配制濃度為15-25mg/ml的六次甲基四胺溶液；配置濃度為0.lmol/L、pH值為7.4、含有卵清蛋白4.5-5.0mg/ml的磷酸鹽緩沖液；將六次甲基四胺溶液緩慢滴加到含卵清蛋白磷酸緩沖溶液中，之后，再加入體積比濃度為20-25%戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置I小時，4°C靜置過夜，裝入透析袋，4°C下在0.01mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中連續(xù)透析5天，每天換液I次，得到的六次甲基四胺包被抗原；所述六次甲基四胺:含卵清蛋白的磷酸緩沖溶液:戊二醛水溶液的添加比例為5-6 mg: 2-5ml: 1-2ml ο
[0014]本發(fā)明步驟(d)中所述包被酶標(biāo)板的包被工藝為:包被酶標(biāo)板的六次甲基四胺包被抗原的濃度為5.8-6.2 μ g/ml，優(yōu)選6 μ g/ml，包被量為95-105 μ I/孔，優(yōu)選100 μ I/孔，4°C包被過夜12h，PBST洗板3次，拍干即可。
[0015]本發(fā)明步驟(d)中所述封閉的工藝為:用質(zhì)量百分比濃度為5%的脫脂奶粉水溶液封閉，其添加量為200 μ I/孔，37°C溫箱孵育封閉lh，PBST洗板3次，拍干即可。
[0016]本發(fā)明步驟(d)中所述加入不同濃度的六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品是指每孔先加入50 μ 1、濃度分別為 10000 ng/ml、100 ng/ml、10 ng/ml、l ng/ml、0.1 ng/ml、0.0Olng/ml 的六次甲基四胺甲醇溶液。
[0017]本發(fā)明步驟(d)中所述加入六次甲基四胺多克隆抗血清的稀釋液的稀釋比例為1:2000，其添加量為50 μ I/孔，37°C溫箱孵育lh, PBST洗板4次，拍干。
[0018]本發(fā)明步驟(d)中所述酶標(biāo)二抗