源于紅樹林沉積物的可降解孔雀石綠的過氧化物酶及制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可降解孔雀石綠的過氧化物酶，尤其是涉及一種源于紅樹林沉積 物的可降解孔雀石綠的過氧化物酶及制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 孔雀石綠（Malachite Green，MG)是一種三苯基甲烷類染料，應用于造紙業(yè)、紡織 業(yè)和皮革業(yè)。而其因具有高效的抗菌作用也被廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)。但近年來的研宄表明孔 雀石綠對哺乳動物細胞有極強的致癌性和致畸變性（Fessard et al. 1999 ;Srivastava et al. 2004)，因此已被許多國家禁止使用。然而由于孔雀石綠在拮抗水產(chǎn)病原菌方面的有效 性且缺乏合適的替代物，導致其仍被大量使用，由此對近海生態(tài)環(huán)境和人類健康造成了很 大程度的威脅。
[0003] 過氧化物酶（Peroxidase, EC 1. 11. 1)是一類以有機物為底物的氧化酶類， 通過奪取其電子并傳遞給活性氧基團以達到清除自由基、保護細胞的作用（Thomas et al. 1980)，同時過氧化物酶也與工業(yè)染料等大分子物質(zhì)降解相關(guān)。Anirban等發(fā)現(xiàn)辣根過 氧化物酶可以降解多種工業(yè)染料（Anirban et al. 2001)，同時Ramesh等和Liaquat等 均發(fā)現(xiàn)一些微生物和動物來源的過氧化物酶對大分子物質(zhì)有著降解的作用（Anirban et al.2001;Ramesh et al.2013;Liaquat et al.2013)。專利方面，多種來源的過氧化物酶被 應用于定量、顯色和化學修飾等領(lǐng)域，但通過紅樹林沉積物宏基因組測序得到的過氧化物 酶應用于孔雀石綠降解及環(huán)境修復上并不多見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一目的是提供一種源于紅樹林沉積物的過氧化酶基因 mgv-peroxidase〇
[0005] 本發(fā)明的第二目的是提供一種由所述過氧化酶基因 mgv-peroxidase編碼的過氧 化物酶Mgv-rPOD。
[0006] 本發(fā)明的第三目的是提供所述過氧化物酶Mgv-rPOD的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第四目的是提供所述過氧化物酶Mgv-rPOD在對孔雀石綠降解中的應 用。
[0008] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0009] 源于紅樹林沉積物的過氧化酶基因 mgv-peroxidase，所述過氧化物酶基因來源于 紅樹林沉積物宏基因組序列；
[0010] 所述過氧化物酶基因 mgv-peroxidase的序列（SEQ ID No. 1)如下：
[0011]
【主權(quán)項】
1. 源于紅樹林沉積物的過氧化酶基因mgv-peroxidase，其特征在于，所述過氧化物酶 基因來源于紅樹林沉積物宏基因組序列； 所述過氧化物酶基因mgv-peroxidase的序列（SEQ ID No. 1)如下： atgtcctgga ttgacgagat tgaaatcgac gaagccgatg gccgcctggG cgaaatttac 60 aaggagttag tcgaaaagcg cggcaaggt.c tccaacatcc tcaaggtgca cagcct.caac 120 cccgaggcga tgtctggtca cctggacctc tacatgacac tgatgttcgg caagtccggc 180 ctgagccgcg ccgaacgcga agcgattggc gtggtcgtct cggcagaaaa. cgattgcgca 240 tactgcgtga accatcatgc cgaggcttta aagcatttca tcaaggacga ggaaacgctg 300 actatgctga tgaccgcaga cgggctggag acgctcgagc cgcgcctgtc caatatcgtt 360 cgccatgcgg aaaagctcac ctctgccccc gaggccatga ccgaatccga tctcggcgaa 4ZU ctcagggctg tgggcctgag cgaccaggac atactcgacc tgacgctcat cgcggcgtat 480 ttcaat-tttg tcaatcgtct- cgtcct-tggc ctcggcgtcg agtac飛cgga agaggaagtc 540 gcgggctatc tcaacgactg a 561 SEQ ID No. 1 的信息： 1) 名稱：過氧化物酶基因mgv-peroxidase ; 2) 分子類型：DNA ; 3) 序列特征： A) 長度：561bp ; B) 類型：核酸； C) 鏈性：雙鏈； D) 拓撲結(jié)構(gòu)：線性。
2. 如權(quán)利要求1所述過氧化酶基因mgv-peroxidase編碼的過氧化物酶Mgv-rPOD，其 特征在于，其氨基酸序列（SEQ ID No. 2)如下： MSWIDEIEID EADGRLAEIY KELVEKRGKV SNILKVHSLN PEAMSGHLDL YMTLMFGKSG 60 LSRAEREAIG VVVSAENDCA YCVNHHAEAL KHFIKDEETL TMLMTADGLE TLEPRLSN1V 120 RHAEKLTSAP EAMTESDLGE LRAVGLSDQD ILDLTLIAAY FNFVNRLVLG LGVEYTEEEV 180 AGYLND 丄8b SEQ ID No. 2 的信息： 1) 名稱：過氧化物酶Mgv-rPOD ; 2) 分子類型：蛋白質(zhì)； 3) 序列特征： A) 長度：186aa ; B) 類型：氨基酸。
3. 如權(quán)利要求2所述過氧化物酶Mgv-rPOD的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1)克隆所述過氧化物酶基因mgv-peroxidase ; 2) 將所述mgv-peroxidase插入表達載體，構(gòu)建攜帶所述過mgv-peroxidase的重組表 達載體； 3) 將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE3)中； 4) 選取轉(zhuǎn)化后E. coli BL21(DE3)中的陽性克隆于培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)； 5) 離心收集發(fā)酵后的E. coli BL21(DE3)細胞，重懸所述E. coli BL21(DE3)細胞于裂 解緩沖液中進行裂解； 6) 將步驟5)中裂解后的懸液進行離心，收集上清液； 7) 將上清液與將上清液與預先結(jié)合附304的RIO-Flammable混勻，4°C結(jié)合45分鐘，用 濃度為200mM的咪唑洗脫即得所述過氧化物酶Mgv-rPOD。
4. 如權(quán)利要求3所述過氧化物酶的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述表達載體 為pET-32a載體。
5. 如權(quán)利要求3所述過氧化物酶的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述培養(yǎng)基為 含有1〇〇1^/1^氨芐青霉素和0.7%葡萄糖的2\￥1'培養(yǎng)基。
6. 如權(quán)利要求3所述過氧化物酶的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述發(fā)酵條件 為：37°C下振蕩培養(yǎng)至A_= 0. 5,加入異丙基硫代-0-D-半乳糖苷至終濃度為ImM，而后 于25°C誘導10小時。
7. 如權(quán)利要求3所述過氧化物酶的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述裂解緩沖 液配方為：〇? 5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH8. 0。
8. 如權(quán)利要求3所述過氧化物酶的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述離心的條 件為 4000rpm，離心 20min。
9. 如權(quán)利要求3所述的過氧化物酶在降解孔雀石綠中的應用。
【專利摘要】源于紅樹林沉積物的可降解孔雀石綠的過氧化物酶及制備，涉及一種過氧化物酶，過氧化物酶基因來自紅樹林沉積物微生物宏基因組序列?？寺∵^氧化物酶基因，再插入表達載體，構(gòu)建攜帶過氧化物酶的重組表達載體；將重組表達載體轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中；選取轉(zhuǎn)化后E.coli BL21(DE3)中的陽性克隆于培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；離心收集發(fā)酵后的E.coli BL21(DE3)細胞，重懸E.coli BL21(DE3)細胞于裂解緩沖液中裂解，離心，收集上清液，再與預先結(jié)合NiSO4的R10-Flammable混勻，咪唑洗脫，得過氧化物Mgv-rPOD。所得過氧化物酶對孔雀石綠具有顯著降解活性。
【IPC分類】A62D3-02, C12N15-70, C12N15-53, A62D101-26, C12N9-08
【公開號】CN104805098
【申請?zhí)枴緾N201510264312
【發(fā)明人】趙晶, 曲武
【申請人】廈門大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月22日