檢測rs632793位點的方法及冠心病左心室收縮功能不全相關(guān)基因的檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及人心房鈉肽/腦鈉肽（NPPA/ NPPB gene)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)位點 rs632793 及 其與左心室收縮功能相關(guān)性的檢測。本發(fā)明還涉及檢測這個SNP位點的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 心力衰竭是危害全球人類健康的主要疾病之一，具有高死亡率，高發(fā)病率，高住院 率和高住院費用的特點。左心室收縮功能不全(左心室射血分?jǐn)?shù)< 45%)是充血性心力衰竭 發(fā)生的早期階段，對左心室收縮功能不全的風(fēng)險預(yù)測和評估有助于延緩心力衰竭的進(jìn)程， 改善心力衰竭病人的生活質(zhì)量和預(yù)后。冠心病是造成左心室收縮功能不全最主要的病因之 一。在冠心病病人中，左心室收縮不全的臨床表現(xiàn)尤為嚴(yán)重，可迅速進(jìn)展為心力衰竭，預(yù)后 極差。目前迫切需要發(fā)現(xiàn)冠心病病人發(fā)生左心室收縮功能不全的風(fēng)險預(yù)測指標(biāo)和預(yù)后評估 革巴點。
[0003] 隨著分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，左心室收縮功能不全認(rèn)為是遺傳因子和環(huán)境共同作用的結(jié) 果。對于環(huán)境因素的控制雖然在一定程度上可延緩左心室收縮不全的發(fā)病和預(yù)后，但對于 固有的遺傳因素的認(rèn)識不足極大地妨礙了對左心室收縮功能不全的研究和判斷。
[0004]目前研究表明左心室收縮功能不全及其隨后心力衰竭的發(fā)生是由一系列神 經(jīng)-體液因素參與。其中，利鈉肽家族扮演重要角色。利鈉肽家族是一組由心肌細(xì)胞分泌 的激素，具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理學(xué)效應(yīng)，主要包括調(diào)節(jié)血壓，抗心肌肥厚，抗心力衰竭 等作用。De Bold等通過電子顯微鏡首次發(fā)現(xiàn)心房肌細(xì)胞分泌的顆粒中包含心房利鈉肽 (ANP) [de Bold AJ, Borenstein HB, Veress AT, et al. A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extract in rats. Life Sci，1981，28(1) :89-94.]。隨后另一利鈉肽家族成員-腦鈉肽（BNP)在豬腦中發(fā)現(xiàn)。ANP和 BNP的作用相似，基因位置毗鄰，形成NPPA-NPPB基因座。NPPA基因（GeneID4878)缺失小 鼠血壓顯著升高，心肌肥厚增加。NPPB基因（GeneID4879)缺失小鼠心肌廣泛纖維化。BNP 與其終末端結(jié)構(gòu)（NT-proBNP)升高被公認(rèn)為左心室功能障礙和心力衰竭的預(yù)測指標(biāo)。
[0005] 盡管如此，對于利鈉肽家族是否對冠心病病人發(fā)生左心室收縮功能不全的風(fēng)險評 估目前尚無定論，這正是當(dāng)前研究左心室收縮功能不全的主要方向之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種NPPA/NPPB基因座啟動子的單核苷酸多態(tài)性基因型的 方法。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種NPPA/NPPB基因座啟動子的單核苷酸多態(tài)性基 因型的檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種NPPA/NPPB基因座啟動子的單核苷酸多態(tài)性基 因型的檢測試劑盒的應(yīng)用。根據(jù)NPPA/NPPB基因座啟動子的單核苷酸多態(tài)性基因型的分型 結(jié)果，可以用于輔助預(yù)測或者判斷冠心病患者的左心室收縮功能不全的易感性。
[0009] 本發(fā)明提供了一種檢測NPPA/NPPB基因座啟動子的單核苷酸多態(tài)性基因型的方 法，該方法包括步驟：
[0010] 用NPPA/NPPB基因座啟動子的特異性引物擴增樣品的基因組DNA，得到擴增產(chǎn)物；
[0011] 和
[0012] 檢測（a)所得的擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點rs632793的基因。
[0013] 所述的單核苷酸多態(tài)性的位點是rs632793。
[0014] rs632793位于NPPA/NPPB基因座啟動子中，片段重疊群contig :NT_021937. 18位 置 6448044A/G。
[0015] 其中，脫氧核糖核酸（DNA)序列編號：rs632793位置基于SEQ ID N0 :1/6 ;擴增產(chǎn) 物基于 SEQ ID N0 :6/6。
[0016] 所述的NPPA/NPPB基因座啟動子的特異性引物的序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03 所示。
[0017] 在本發(fā)明的一個實施例中，擴增反應(yīng)時，退火/延伸的溫度為60°C。更好的，在擴 增反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中，退火和延伸的步驟均為：60°C，30秒。
[0018] 所述的擴增產(chǎn)物的序列如SEQ IDN06所示。
[0019] 所述的方法包括利用與位點rs632793結(jié)合的探針檢測NPPA/NPPB基因座啟動子 的單核苷酸多態(tài)性基因型。
[0020] 第二方面，本發(fā)明還提供了一種針對冠心病病人左心室收縮功能不全易感基因的 檢測試劑盒，它包括特異性擴增NPPA/NPPB基因座啟動子的引物。
[0021] 所述的NPPA/NPPB基因座啟動子的特異性引物的序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03 所示。
[0022] 所述的檢測試劑盒還含有常規(guī)的檢測基因型的試劑。例如，含有與位點rs632793 結(jié)合的探針。
[0023] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的與位點rs632793結(jié)合的探針的序列如SEQ ID N04或者SEQ IDN05所示。
[0024] 本發(fā)明的檢測試劑盒和檢測方法可以用于檢測NPPA/NPPB基因座啟動子的單核 苷酸多態(tài)性基因型。具體而言，是對rs632793進(jìn)行基因分型。
[0025] 所述的NPPA/NPPB基因座啟動子的單核苷酸多態(tài)性基因型為A和/或G。
[0026] 利用對個體的左心室收縮功能不全易感性相關(guān)基因的基因型進(jìn)行判斷的方法，即 檢測該個體的NPPA/NPPB基因rs632793位點的基因型，可以輔助判斷該個體患左心室收縮 功能不全的發(fā)病風(fēng)險。rs632793帶有G等位基因的病人患左心室收縮功能不全的發(fā)病風(fēng)險 顯著高于對照組。
[0027] 本發(fā)明檢測試劑盒和檢測方法可以用于預(yù)測左心室收縮功能不全易感性，也可以 在冠心病患者基因治療后判斷或者輔助判斷患者的康復(fù)前景。
[0028] 此外，本發(fā)明的檢測試劑盒和檢測方法還可以篩選治療冠心病患者左心室收縮功 能不全的藥物，甚至用于作為相關(guān)藥劑的靶標(biāo)。
[0029] 本發(fā)明公開了一種檢測NPPA/NPPB基因座啟動子中rs632793位點的方法，它包括 檢測個體的心房鈉肽（NPPA)/腦鈉肽（NPPB) rs632793位點的基因型。本發(fā)明還公開了相 應(yīng)的檢測試劑盒。本發(fā)明的檢測方法簡便易行，成本低廉，高效快速，結(jié)果明了?？梢源蟠?減輕患者的負(fù)擔(dān)，為左心室收縮功能不全患者的用藥方案提供了參考。
【附圖說明】
[0030] 圖1顯示了第96號樣本基因組DNA抽提的檢測結(jié)果
[0031] 圖2顯示了NPPA/NPPB rs632793位于NPPA/NPPB基因座啟動子中（片段重疊群 contig :NT_021937. 18位置6448044A/G)的一種SNP基因型的測序結(jié)果。
【具體實施方式】
[0032] 本發(fā)明人經(jīng)過多年研究，發(fā)現(xiàn)利鈉肽家族是當(dāng)下尋找的左心室收縮功能不全的一 個重要的候選基因座及靶點。以此為目標(biāo)，開發(fā)檢測左心室收縮功能不全相關(guān)易感基因的 方法、試劑盒，以及治療藥物對揭示左心室收縮功能不全的病理生理途徑有重要作用，有助 于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)遺傳因素對心血管疾病的影響，同時為預(yù)測預(yù)防心力衰竭做出有益的嘗試。
[0033] 在冠心病病人中首次證明了NPPA/NPPB基因單核苷酸多態(tài)性位點rs632793(位 于NPPA/NPPB基因座啟動子中，片段重疊群contig :NT_021937. 18位置6448044A/G)與 左心室收縮功能不全密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能：NPPA/NPPB基因單核苷酸多態(tài)性 位點rs632793位于NPPA/NPPB基因座啟動子中（片段重疊群contig :NT_021937. 18位置 6448044A/G)基因型的改變將導(dǎo)致左心室收縮功能不全的發(fā)病風(fēng)險升高，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié) 果顯示，在冠心病病人中，NPPA/NPPB基因rs632793A - G在病例和對照組中的分布存在顯 著性差異（P〈〇. 05)，該SNP多態(tài)性可參與改變啟動子活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0034] NPPA/NPPB基因的詳細(xì)序列可參見登錄號為rs632793的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0035] 本發(fā)明對NPPA/NPPB基因座啟動子中（片段重疊群contig :NT_021937. 18位置 6448044)區(qū)域進(jìn)行了測序。
[0036] NPPA/NPPB基因rs632793位點的多態(tài)性可直接用于針對冠心病病人的左心室收 縮功能不全的個性化治療。在利用本發(fā)明NPPA/NPPB基因rs632793位點的多態(tài)性時，還可 同時使用其他治療左心室收縮功能不全的藥劑。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效的本發(fā)明NPPA/NPPB多肽以及 藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘 油、乙醇、及其組合