一種蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蟲(chóng)草素是蟲(chóng)草中主要的活性成分之一。蟲(chóng)草素具有多種生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗增殖、抗轉(zhuǎn)移、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗炎等。蟲(chóng)草素的制備主要有化學(xué)合成和生物合成兩種方式。由于目前化學(xué)合成蟲(chóng)草素生產(chǎn)成本高，合成工藝復(fù)雜，收率低，產(chǎn)物純化比較難，所以蟲(chóng)草素主要由生物合成法制備。生物合成法制備蟲(chóng)草素有兩種途徑:一是固體發(fā)酵獲得蟲(chóng)草子實(shí)體，再?gòu)闹刑崛。欢峭ㄟ^(guò)蟲(chóng)草液體發(fā)酵，從發(fā)酵液中直接提取。由于液體發(fā)酵比固體發(fā)酵在發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)速率、生長(zhǎng)密度以及可控性上的優(yōu)勢(shì)，蟲(chóng)草液體發(fā)酵提取蟲(chóng)草素成為主要的蟲(chóng)草素制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可產(chǎn)生大量子實(shí)體的蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基。
[0004]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述固體培養(yǎng)基的制備方法。
[0005]本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述固體培養(yǎng)基的應(yīng)用。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]一種蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基的制備方法，它包括如下步驟:
[0008]I)將葡萄糖40?50g/L，酵母膏3?10g/L，蛋白胨5?15g/L，磷酸二氫鉀0.2?1.0g/L，磷酸氫二鉀0.2?L Og/L，硫酸鎂0.2?L Og/L，吐溫80 0.5?5.0g/L，溶劑為水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笳{(diào)節(jié)溶液pH值5.5?6.0，制得發(fā)酵培養(yǎng)液；
[0009]2)將步驟I)中的發(fā)酵培養(yǎng)液與膨脹珍珠巖混合均勻，經(jīng)噴霧干燥后裝入發(fā)酵罐，121°C蒸汽滅菌20min，獲得蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基。
[0010]步驟I)中，將葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫802g/L，溶劑為水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笳{(diào)節(jié)溶液pH值5.8，制得發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0011 ] 步驟2)中，所述的膨脹珍珠巖粒徑為4?8mm，優(yōu)選6mm。
[0012]步驟2)中，發(fā)酵培養(yǎng)液與膨脹珍珠巖的體積質(zhì)量比為30?50ml/g，優(yōu)選40ml/g。
[0013]步驟2)中，噴霧干燥后的物料含水量控制在2.5-5ml/g，優(yōu)選4ml/g。
[0014]上述制備方法制備得到的蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0015]上述蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基在發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草素中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0016]具體的應(yīng)用方法是，將在PDA斜面培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的蛹蟲(chóng)草菌種用5ml無(wú)菌生理鹽水洗下，制成菌懸液，接種至滅菌好的裝有50ml的發(fā)酵培養(yǎng)液搖瓶中，于27°C，ISOrpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)4天，加入無(wú)菌水450ml，混合均勻后，再以Iwt %接種至滅菌好的蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢枋咕N均勻分布于蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基中，每24h時(shí)以lwt%比例補(bǔ)水維持相對(duì)濕度，并攪拌翻料，同時(shí)從發(fā)酵罐底部通入相對(duì)濕度為80%的無(wú)菌空氣，通氣比為0.SmirT1，27°C培養(yǎng)4天后，通氣比降為0.51Γ1，每5天以5wt%噴淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和2?6g/L(優(yōu)選4g/L)三油酸甘油酯的培養(yǎng)液使其產(chǎn)生大量的子實(shí)體，其余條件不變，再培養(yǎng)21天后發(fā)酵結(jié)束；加入1.5倍固料體積的水，80°C攪拌翻料2h，過(guò)濾收集濾液；水煮過(guò)程進(jìn)行三次，合并濾液，濃縮至固料體積，得到蟲(chóng)草素提取液。
[0017]上述蛹蟲(chóng)草菌種為任意具有蟲(chóng)草素生產(chǎn)能力的蛹蟲(chóng)草菌種，例如可以是購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為CICC 14014的菌株。
[0018]本技術(shù)通過(guò)培養(yǎng)液在20目膨脹珍珠巖上的吸附，發(fā)揮固體發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，克服其缺陷，利用20目膨脹珍珠巖中豐富的比表面積達(dá)到大量生產(chǎn)子實(shí)體的目的。眾所周知，蟲(chóng)草素通常富集于蛹蟲(chóng)草子實(shí)體頂部。
[0019]我們通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研和研宄發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草素的直接前體是腺嘌呤，而蟲(chóng)草素的另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元是3’ -脫氧核糖。在蛹蟲(chóng)草發(fā)酵中，我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入腺嘌呤能大大提高蟲(chóng)草素產(chǎn)量。而且，我們還發(fā)現(xiàn)加入植物油后蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中的蟲(chóng)草素含量又有進(jìn)一步升尚O
[0020]蛹蟲(chóng)草傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是應(yīng)用葡萄糖、蛋白胨和酵母膏為主要成分的發(fā)酵培養(yǎng)基。這些成分只能滿足蛹蟲(chóng)草基本的生長(zhǎng)和發(fā)育需要，蟲(chóng)草素產(chǎn)量較低。而加入腺嘌呤后提供了一定的蟲(chóng)草素前體，使得蟲(chóng)草素產(chǎn)量有所提高。但是3’ -脫氧核糖單元是通過(guò)脂肪酸代謝途徑，經(jīng)乙酰CoA，再經(jīng)過(guò)次級(jí)代謝途徑合成的，這與先前理解的3’ -脫氧核糖是通過(guò)磷酸戊糖途徑合成的有差別。因此，在缺乏乙酰CoA供給的條件下，蟲(chóng)草素含量很難再提高。而植物油等甘油酯在蛹蟲(chóng)草中通過(guò)脂肪酸代謝能夠分解為大量的乙酰CoA，進(jìn)而能夠進(jìn)一步提高蟲(chóng)草素的產(chǎn)量。
[0021]本發(fā)明的有益效果:
[0022]1、本發(fā)明所采用的20目膨脹珍珠巖作為支持介質(zhì)，其比表面積為10m2/g(內(nèi)徑為10米的發(fā)酵罐，在非攪拌條件下氣液界面僅為78.5m2，僅相當(dāng)于8g20目膨脹珍珠巖)，孔隙率達(dá)到50-90%，這些有利于傳質(zhì)及子實(shí)體生長(zhǎng)和孢子的產(chǎn)生，同步性佳。
[0023]2、根據(jù)蛹蟲(chóng)草菌體生長(zhǎng)和蟲(chóng)草素積累所需的不同供氧條件，利用通氣比來(lái)改變，影響因素少，更簡(jiǎn)單方便。
[0024]3、本發(fā)明加入腺嘌呤和三油酸甘油酯，提供蟲(chóng)草素的兩種前體，更有利于蟲(chóng)草素的積累。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為不同培養(yǎng)基對(duì)蟲(chóng)草素含量的影響圖，其中橫坐標(biāo)I為實(shí)施例4，2為實(shí)施例5，3為實(shí)施例6，4為對(duì)比例1，5為對(duì)比例2，縱坐標(biāo)代表測(cè)得的發(fā)酵液或蟲(chóng)草素提取液中蟲(chóng)草素含量。
[0026]圖2為不同培養(yǎng)基對(duì)子實(shí)體濃度的影響圖，其中橫坐標(biāo)I為實(shí)施例4，2為實(shí)施例5，3為實(shí)施例6，4為對(duì)比例1，5為對(duì)比例2，縱坐標(biāo)代表測(cè)得的子實(shí)體濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0028]若未特別指明，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0029]實(shí)施例1:蛹蟲(chóng)草發(fā)酵固體培養(yǎng)基制備。
[0030]I)葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫80 2g/L，溶劑為水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笳{(diào)節(jié)溶液pH值5.8，制得發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0031]2)將步驟I)中的發(fā)酵培養(yǎng)液與粒徑6mm的膨脹珍珠巖按照體積質(zhì)量比為40ml/g混合攪拌，經(jīng)噴霧干燥后，物料含水量控制在4ml/g裝入發(fā)酵罐，121°C蒸汽滅菌20min，獲得蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基。
[0032]實(shí)施例2:蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基制備。
[0033]I)葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫80 2g/L，溶劑為水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笳{(diào)節(jié)溶液pH值5.8，制得發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0034]2)將步驟I)中的發(fā)酵培養(yǎng)液與粒徑4mm的膨脹珍珠巖按照體積質(zhì)量比為30ml/g混合攪拌，經(jīng)噴霧干燥后，物料含水量控制在5ml/g裝入發(fā)酵罐，121°C蒸汽滅菌20min，獲得蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基。
[0035]實(shí)施例3:蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基制備。
[0036]I)葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫80 2g/L，溶劑為水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笳{(diào)節(jié)溶液pH值5.8，制得發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0037]2)將步驟I)中的發(fā)酵培養(yǎng)液與粒徑8mm的膨脹珍珠巖按照體積質(zhì)量比為50ml/g混合攪拌，經(jīng)噴霧干燥后，物料含水量控制在2.5ml/g裝入發(fā)酵罐，121°C蒸汽滅菌20min，獲得蟲(chóng)草素發(fā)酵固體培養(yǎng)基。
[0038]實(shí)施例4:蛹蟲(chóng)草固體發(fā)酵培養(yǎng)基在提高蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素產(chǎn)量上的應(yīng)用。
[0039]1、從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買(mǎi)的蛹蟲(chóng)草菌種(編號(hào):CICC14014)保藏在安瓿管中，處于凍干狀態(tài)，在實(shí)驗(yàn)之前需要恢復(fù)菌種活性。在超凈工作臺(tái)中，用浸過(guò)70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，使安瓿管頂端在火焰上加熱，向加熱處滴幾滴無(wú)菌水使玻璃開(kāi)裂。用鑷子敲下已開(kāi)裂的安瓿管頂端，加入0.5ml 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0.2ml菌體懸浮液加至斜面培養(yǎng)基中，25 °C恒溫培養(yǎng)7d。
[0040]2、將在PDA斜面培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的菌種用5ml無(wú)菌生理鹽水洗下，制成菌懸液，接種至滅菌好的裝有50ml的發(fā)酵培養(yǎng)液搖瓶中，于27°C，180rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)4天，加入無(wú)菌水450ml，混合均勻后，再以Iwt %接種至滅菌好的實(shí)施例1固料培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢枋咕N均勻分布于培養(yǎng)基中，每24h時(shí)以1被％比例補(bǔ)水維持適當(dāng)?shù)南鄬?duì)濕度，并攪拌翻料，同時(shí)從發(fā)酵罐底部通入相對(duì)濕度為80%的無(wú)菌空氣，通氣比為0.SmirT1JTO培養(yǎng)4天后，通氣比降為0.51Γ1，每5天以5wt%噴淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和4g/L三油酸甘油酯的培養(yǎng)液使其產(chǎn)生大量的子實(shí)體，其余條件不變，再培養(yǎng)21天后發(fā)酵結(jié)束。加入1.5倍固料體積的水，80°C攪拌翻料2h，過(guò)濾收集濾液。水煮過(guò)程進(jìn)行三次，合并濾液，濃縮至固料體積，得到蟲(chóng)草素提取液。
[0041]實(shí)施例5:蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基在提高蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量上的應(yīng)用
[0042]1、從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買(mǎi)的蛹蟲(chóng)草菌種(編號(hào):CICC14014)保藏在安瓿管中，處于凍干狀態(tài)，在實(shí)驗(yàn)之前需要恢復(fù)菌種活性。在超凈工作臺(tái)中，用浸過(guò)70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，使安瓿管頂端在火焰上加熱，向加熱處滴幾滴無(wú)菌水使玻璃開(kāi)裂。用鑷子敲下已開(kāi)裂的安瓿管頂端，加入0.5ml 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0.2ml菌體懸浮液加至斜面培養(yǎng)基中，25 °C恒溫培養(yǎng)7d。