br>[0007]—種利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法，包括以下步驟:
(I)、煙腈水合酶生產(chǎn)菌細(xì)胞的培養(yǎng):
a、取葡萄糖50g，瓊脂 25 g，牛肉膏 55g，MgS04 0.7g, NaCl 13 g，KH2P04 0.8 g,K2HP04 1.2g，溶于適量水中，定容至lOOOmL，然后調(diào)pH至7.0，
作為細(xì)菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；將枯草芽孢桿菌放在紫外燈的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，得到枯草芽孢桿菌的突變株體作為菌種。將培養(yǎng)基滅菌后接入培養(yǎng)基體積的3%的菌種，于搖床上以60-200rpm恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 °C，培養(yǎng)時(shí)間24_72h，得到種子液；然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基消毒后接入培養(yǎng)基體積的4%的種子液，發(fā)酵前中期發(fā)酵罐的通氣量為1:0.7-0.9V / V.min，后期的通氣量為為 1:(X3-(X4V / V.min，發(fā)酵溫度為 25-35 °C，以70-150rpm的速度攪拌發(fā)酵40_80h，得到發(fā)酵液，發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，讓罐壓先慢慢上升，然后再緩慢下降；要求罐壓在24小時(shí)之內(nèi)控制在0.04-0.05MPa下，以后罐壓的變化為24-48小時(shí)控制在0.045-0.055MPa下，48-72小時(shí)控制在0.035-0.045MPa下，72小時(shí)之后控制在
0.025-0.035MPa的壓力下；其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:1_5%葡萄糖，1_5%液化淀粉、1_5%玉米漿、0.5-5% 酵母膏，0.1-1% 蛋氨酸，0.03-0.2%Κ2ΗΡ04，0.01-0.l%MgS04，0.01-0.l%ZnS04、
0.01-0.l%CuS04、5-10ppmCoCl2，pH 7.0-7.5 ；
b、將發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，去除上清液，得到濕的產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞，加入濕的產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞質(zhì)量的1-2%的羧甲基纖維素鈉，適量的去離子水，充分?jǐn)嚢栊纬蓾舛葹?0-25%的產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞懸濁液，再將此懸濁液注射到到濃度為3-5 %的CaC12水溶液中，注射結(jié)束以后低溫保存，得固定化細(xì)胞懸濁液，即煙腈水合酶生產(chǎn)菌細(xì)胞懸濁液；
(2 )、煙腈水合酶催化水合反應(yīng)
在反應(yīng)釜中，先添加容器量的50-60%的去離子水，調(diào)pH到7.0，采用分批加料的方式先向反應(yīng)釜中首次添加底物3-氰基吡啶和上述獲得的生物催化劑固定化細(xì)胞懸濁液，在18-22°C, 50-200rpm的攪拌速度下進(jìn)行生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每隔I小時(shí)對(duì)反應(yīng)液中的3-氰基吡啶濃度進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)濃度低于0.5g/L時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)加底物和生物催化劑固定化細(xì)胞懸濁液，補(bǔ)加的量與起始量一致，底物煙腈反應(yīng)一定時(shí)間后，用HPLC法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中煙腈殘留量，當(dāng)煙腈殘留量接近零時(shí)，即為生物催化反應(yīng)的終點(diǎn)，所述的底物3-氰基吡啶和生物催化劑固定化細(xì)胞懸濁液的每批添加質(zhì)量比為5:1 ;
(3)、煙酰胺的提取純化工藝:
a、當(dāng)轉(zhuǎn)化液中煙酰胺的濃度在室溫下達(dá)55-58%，開(kāi)始冷卻析晶，在結(jié)晶過(guò)程中開(kāi)啟攪拌，且當(dāng)溫度降到10-11 °0時(shí)加入適量晶種，促使晶核形成并緩慢生長(zhǎng)，所得煙酰胺晶體大，色澤好，過(guò)濾出晶體，得到一次母液，一次母液直接冷卻析出煙酰胺晶體，濾出晶體，得到二次母液；
b、所得二次母液中煙酰胺濃度為25-28%，先真空蒸發(fā)出一部分水分，使得溶液達(dá)到飽和狀態(tài)再進(jìn)行下一步的冷卻析晶，所得三次母液在大生產(chǎn)時(shí)可套用至下一批轉(zhuǎn)化液中，合并多次結(jié)晶的晶體，即為成品。
[0008]最終獲得的煙酰胺純度在99.9%。轉(zhuǎn)化率為99.5%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)、煙腈水合酶生產(chǎn)菌細(xì)胞的培養(yǎng): a、取葡萄糖40-60g，瓊脂 20-30 g，牛肉膏 50-60 g, MgSO4 0.6_lg，NaCl 10-15 g,KH2PO4 0.7-1 g，K2HPO4 0.8_1.5g，溶于適量水中，定容至 1000mL，然后調(diào) pH 至 6.8_7.2，作為細(xì)菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；將枯草芽孢桿菌放在紫外燈的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，得到枯草芽孢桿菌的突變株體作為菌種，將培養(yǎng)基滅菌后接入培養(yǎng)基體積的1-5%的菌種，于搖床上以60-200rpm恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-31 V，培養(yǎng)時(shí)間24_72h，得到種子液；然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基消毒后接入培養(yǎng)基體積的2-5%的種子液，發(fā)酵前中期發(fā)酵罐的通氣量為1:0.7-0.9V / ν.π?η，后期的通氣量為為1:0.3-0.4V / V.π?η，發(fā)酵溫度為25-35 °C，以70-150rpm的速度攪拌發(fā)酵40_80h，得到發(fā)酵液，發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，讓罐壓先慢慢上升，然后再緩慢下降；要求罐壓在24小時(shí)之內(nèi)控制在0.04-0.05MPa下，以后罐壓的變化為24-48小時(shí)控制在0.045-0.055MPa下，48-72小時(shí)控制在0.035-0.045MPa下，72小時(shí)之后控制在0.025-0.035MPa 的壓力下； b、將發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，去除上清液，得到濕的產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞，加入濕的產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞質(zhì)量的1-2%的羧甲基纖維素鈉，適量的去離子水，充分?jǐn)嚢栊纬蓾舛葹?0-25%的產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞懸濁液，再將此懸濁液注射到到濃度為3-5 %的CaCl2水溶液中，注射結(jié)束以后低溫保存，得固定化細(xì)胞懸濁液，即煙腈水合酶生產(chǎn)菌細(xì)胞懸濁液； (2 )、煙腈水合酶催化水合反應(yīng) 在反應(yīng)釜中，先添加容器量的50-60%的去離子水，調(diào)pH到7.0，采用分批加料的方式先向反應(yīng)釜中首次添加底物3-氰基吡啶和上述獲得的生物催化劑固定化細(xì)胞懸濁液，在18-22°C, 50-200rpm的攪拌速度下進(jìn)行生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每隔I小時(shí)對(duì)反應(yīng)液中的3-氰基吡啶濃度進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)濃度低于0.5g/L時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)加底物和生物催化劑固定化細(xì)胞懸濁液，補(bǔ)加的量與起始量一致，底物煙腈反應(yīng)一定時(shí)間后，用HPLC法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中煙腈殘留量，當(dāng)煙腈殘留量接近零時(shí)，即為生物催化反應(yīng)的終點(diǎn)，所述的底物3-氰基吡啶和生物催化劑固定化細(xì)胞懸濁液的每批添加質(zhì)量比為5:1 ; (3)、煙酰胺的提取純化工藝: a、當(dāng)轉(zhuǎn)化液中煙酰胺的濃度在室溫下達(dá)55-58%，開(kāi)始冷卻析晶，在結(jié)晶過(guò)程中開(kāi)啟攪拌，且當(dāng)溫度降到10-11 °0時(shí)加入適量晶種，促使晶核形成并緩慢生長(zhǎng)，所得煙酰胺晶體大，色澤好，過(guò)濾出晶體，得到一次母液，一次母液直接冷卻析出煙酰胺晶體，濾出晶體，得到二次母液； b、所得二次母液中煙酰胺濃度為25-28%，先真空蒸發(fā)出一部分水分，使得溶液達(dá)到飽和狀態(tài)再進(jìn)行下一步的冷卻析晶，所得三次母液在大生產(chǎn)時(shí)可套用至下一批轉(zhuǎn)化液中，合并多次結(jié)晶的晶體，即為成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:1-5%葡萄糖，1-5%液化淀粉、1-5%玉米漿、0.5-5%酵母膏，0.1-1% 蛋氨酸，0.03-0.2%Κ2ΗΡ04，0.01-0.l%MgS04，0.01-0.l%ZnS04、0.01-0.1%CuS04、5_10ppmCoCl2，pH 7.0-7.5。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法，包括煙腈水合酶生產(chǎn)菌細(xì)胞的培養(yǎng)、固定化細(xì)胞的制備、固定化細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化煙腈生產(chǎn)煙酰胺化水合反應(yīng)、煙酰胺的提取工藝。本發(fā)明方法中采用固定化細(xì)胞作為催化劑，可以使生物催化劑多次重復(fù)利用，降低了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了工藝，產(chǎn)物產(chǎn)率有著很大的提高。本方法工藝簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，純度高。
【IPC分類】C12P17-12
【公開(kāi)號(hào)】CN104762340
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510115815
【發(fā)明人】劉善和, 錢(qián)前, 梁錫臣, 趙廣福, 周浩
【申請(qǐng)人】安徽瑞邦生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日