一種利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物法合成領(lǐng)域，具體涉及一種利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]煙酰胺又稱尼克酰胺，維生素B3，英文Nicotinamide，分子式C6H6N20，分子量122.13，白色針狀結(jié)晶或粉末，有苦味，無(wú)臭，熔點(diǎn)128~131 °C，比重1.400，易溶于水、醇和甘油。在空氣中穩(wěn)定，不吸潮。主要作為飼料的營(yíng)養(yǎng)性添加劑(水溶性維生素)，也用于食品、醫(yī)藥、染料的中間體，同時(shí)用作電鍍液的添加劑和生化試劑。煙酸、煙酰胺屬B族維生素，通稱VB，在實(shí)際應(yīng)用中可等量替代，自然界的煙酸存在于肝、腎、酵母和米糠中，是生物體內(nèi)脫氫輔酶I或II的組分，參與碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。它們?cè)卺t(yī)藥中可用于治療糙皮病等，還可以添加到食品和面粉中用以補(bǔ)充人體所需的維生素，其最大的應(yīng)用領(lǐng)域是用作飼料添加劑。
[0003]工業(yè)上，煙酰胺、煙酸主要是以吡啶類化合物為原料生產(chǎn)的，世界煙酰胺、煙酸的生產(chǎn)主要集中在西歐和美國(guó)，日本也有少量生產(chǎn)。我國(guó)煙酸、煙酰胺的產(chǎn)量很少，只用于制藥工業(yè)，因生產(chǎn)工藝水平落后，飼料工業(yè)中大量所需的煙酸、煙酰胺主要依賴進(jìn)口。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的騰飛，人民生活水平迅速提高，食品結(jié)構(gòu)從植物型轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)物型，飼料工業(yè)隨之迅速發(fā)展:飼料中添加煙酸、煙酰胺后可提高畜禽的抗病、防病能力，加快生長(zhǎng)速度，降低飼料成本。另外，我國(guó)人口眾多，如果在醫(yī)藥和食品中加入適量的煙酰胺、煙酸對(duì)于提高人民的身體和健康水平具有重要意義。煙酸、煙酰胺在我國(guó)食品的應(yīng)用尚未開發(fā)，因此盡快建設(shè)具有一定經(jīng)濟(jì)規(guī)模的生產(chǎn)裝置，批量生產(chǎn)煙酸、煙酰胺，不僅有很大的現(xiàn)存市場(chǎng)，還有巨大的潛在市場(chǎng)。目前生產(chǎn)煙酰胺的工藝分為兩大類，一種是化學(xué)合成法和另外一種是生物合成法?；瘜W(xué)法主要是米用3_甲基卩比啶、2_甲基-1，5-戊二胺、2_甲基_5_乙基卩比啶等為初始原料，通過(guò)氧化劑直接氧化或催化氧化生成3-氰基吡啶，再經(jīng)過(guò)堿液水解生產(chǎn)煙酰胺。常用的氧化劑有硝酸、臭氧、過(guò)氧化氫、和高錳酸鉀。這些工藝雖然比較成熟，但是原料和催化劑價(jià)格昂貴，消耗量大，成本高，收率低，對(duì)環(huán)境的污染很大，很難進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。生物合成法就是利用微生物發(fā)酵，產(chǎn)生生物酶，用生物酶催化反應(yīng)的方法。采用微生物細(xì)胞中產(chǎn)生的腈水合酶轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶生成煙酰胺。微生物法生產(chǎn)煙酰胺反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物產(chǎn)率和純度高，價(jià)格便宜，消耗量小，成本低，環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，這些相比較化學(xué)合成法有著明顯的優(yōu)勢(shì)。因而越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)微生物法進(jìn)行了研宄。瑞士隆薩股份公司的J(赫夫林等人的發(fā)明專利“煙酰胺的制備方法”。在此發(fā)明中2-甲基-1，5-二氨基戊烷經(jīng)催化、氨氧化、微生物法轉(zhuǎn)化為煙酰胺。微生物反應(yīng)采用紅球菌屬微生物或其功能相當(dāng)?shù)淖凅w和突變株體進(jìn)行。3-甲基吡啶轉(zhuǎn)化為3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%，生產(chǎn)得到的煙酰胺純度達(dá)99.5%以上。但此過(guò)程步驟繁多，工藝復(fù)雜。上海市農(nóng)藥研宄所的沈寅初等人的發(fā)明專利“微生物催化法生產(chǎn)煙酰胺”采用接近棒桿菌產(chǎn)生的腈水合酶將3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化成煙酰胺。生產(chǎn)的煙酰胺的純度和收率都(99.0%，雖然純度和收率都很高，但是棒桿菌的培養(yǎng)是相當(dāng)困難的，不適用與大規(guī)模的生產(chǎn)。浙江愛迪亞營(yíng)養(yǎng)科技開發(fā)有限公司的鄒軍華等人的發(fā)明專利“一種谷氨酸棒桿菌及其應(yīng)用于制備煙酰胺的方法”采用谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生的腈水合酶于3-氰基吡啶水合反應(yīng)得煙酰胺。所得煙酰胺的純度達(dá)99.8%以上。但是這些方法對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)來(lái)說(shuō)很不方便，不利于工藝的簡(jiǎn)化，生產(chǎn)成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法。本方法工藝簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，純度高。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法，其特征在于，包括以下步驟:
(I)、煙腈水合酶生產(chǎn)菌細(xì)胞的培養(yǎng):
a、取葡萄糖 40-60g，瓊脂 20-30 g，牛肉膏 50-60 g, MgSO4 0.6_lg，NaCl 10-15 g,KH2PO4 0.7-1 g，K2HPO4 0.8_1.5g，溶于適量水中，定容至 1000mL，然后調(diào) pH 至 6.8_7.2，作為細(xì)菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；將枯草芽孢桿菌放在紫外燈的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，得到枯草芽孢桿菌的突變株體作為菌種，將培養(yǎng)基滅菌后接入培養(yǎng)基體積的1-5%的菌種，于搖床上以60-200rpm恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-31 V，培養(yǎng)時(shí)間24_72h，得到種子液；然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基消毒后接入培養(yǎng)基體積的2-5%的種子液，發(fā)酵前中期發(fā)酵罐的通氣量為1:0.7-0.9V / ν.π?η，后期的通氣量為為1:0.3-0.4V / V.π?η，發(fā)酵溫度為25-35 °C，以70-150rpm的速度攪拌發(fā)酵40_80h，得到發(fā)酵液，發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，讓罐壓先慢慢上升，然后再緩慢下降；要求罐壓在24小時(shí)之內(nèi)控制在0.04-0.05MPa下，以后罐壓的變化為24-48小時(shí)控制在0.045-0.055MPa下，48-72小時(shí)控制在0.035-0.045MPa下，72小時(shí)之后控制在0.025-0.035MPa 的壓力下；
b、將發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，去除上清液，得到濕的產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞，加入濕的產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞質(zhì)量的1-2%的羧甲基纖維素鈉，適量的去離子水，充分?jǐn)嚢栊纬蓾舛葹?0-25%的產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞懸濁液，再將此懸濁液注射到到濃度為3-5 %的CaCl2水溶液中，注射結(jié)束以后低溫保存，得固定化細(xì)胞懸濁液，即煙腈水合酶生產(chǎn)菌細(xì)胞懸濁液；
(2 )、煙腈水合酶催化水合反應(yīng)
在反應(yīng)釜中，先添加容器量的50-60%的去離子水，調(diào)pH到7.0，采用分批加料的方式先向反應(yīng)釜中首次添加底物3-氰基吡啶和上述獲得的生物催化劑固定化細(xì)胞懸濁液，在18-22°C, 50-200rpm的攪拌速度下進(jìn)行生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每隔I小時(shí)對(duì)反應(yīng)液中的3-氰基吡啶濃度進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)濃度低于0.5g/L時(shí)，開始補(bǔ)加底物和生物催化劑固定化細(xì)胞懸濁液，補(bǔ)加的量與起始量一致，底物煙腈反應(yīng)一定時(shí)間后，用HPLC法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中煙腈殘留量，當(dāng)煙腈殘留量接近零時(shí)，即為生物催化反應(yīng)的終點(diǎn)，所述的底物3-氰基吡啶和生物催化劑固定化細(xì)胞懸濁液的每批添加質(zhì)量比為5:1 ;
(3)、煙酰胺的提取純化工藝:
a、當(dāng)轉(zhuǎn)化液中煙酰胺的濃度在室溫下達(dá)55-58 %，開始冷卻析晶，在結(jié)晶過(guò)程中開啟攪拌，且當(dāng)溫度降到10-11 °0時(shí)加入適量晶種，促使晶核形成并緩慢生長(zhǎng)，所得煙酰胺晶體大，色澤好，過(guò)濾出晶體，得到一次母液，一次母液直接冷卻析出煙酰胺晶體，濾出晶體，得到二次母液； b、所得二次母液中煙酰胺濃度為25-28%，先真空蒸發(fā)出一部分水分，使得溶液達(dá)到飽和狀態(tài)再進(jìn)行下一步的冷卻析晶，所得三次母液在大生產(chǎn)時(shí)可套用至下一批轉(zhuǎn)化液中，合并多次結(jié)晶的晶體，即為成品。
所述的利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:1-5%葡萄糖，1-5%液化淀粉、1-5%玉米漿、0.5-5%酵母膏，0.1-1%蛋氨酸，0.03-0.2%Κ2ΗΡ04，0.01-0.l%MgS04，0.01-0.l%ZnS04、0.01-0.l%CuS04、5_10ppmCoCl2，pH7.0-7.5。
[0006]本發(fā)明的利用固定化細(xì)胞將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法中，將產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞固定，采用固定化細(xì)胞作為生物催化劑將煙腈轉(zhuǎn)化為煙酰胺的方法，同時(shí)又采用底物和產(chǎn)腈水合酶分批加料的方式多次補(bǔ)加，采用分批少量多次添加底物3-氰基吡啶，少量多次的加入對(duì)固定化細(xì)胞的毒性作用小，提高了生化反應(yīng)的酶活性，有利于固定化細(xì)胞的多次轉(zhuǎn)化，節(jié)約了成本、提高了轉(zhuǎn)化率，同時(shí)減少了濃縮處理，簡(jiǎn)便了后期的分離提純的工藝，最終獲得的煙酰胺純度在99.8%以上。
【具體實(shí)施方式】<