一種雞顯性白羽基因的鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于動物遺傳育種領域，涉及一種雞顯性白羽基因的鑒定方法。
【背景技術】
[0002]雞羽色表型是一類復雜的質量性狀，受多種基因調控。羽色性狀的相關研究較多， 但相關基因功能及其突變的研究較少，目前只有少部分基因得到證實與特定羽色的形成有 關。
[0003] 雞的羽色可分為白羽和有色羽。雞的白羽又分為顯性白羽和隱性白羽兩類。其 中，顯性白羽雞以白來航雞為代表，隱性白羽雞如絲羽烏骨雞和各種隱性白雞，有色羽雞如 壽光雞等。
[0004] 顯性白羽基因是影響雞羽色的一個主要基因座位，定位于第22連鎖群 (E22C19W28)，該連鎖群與人類第12號及小鼠第10號染色體同源，該基因編碼黑素細胞特 異的PMEL17蛋白。該基因在真黑素小體早期發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵作用，當黑色素在成熟的 黑素體中合成時，會沉積在一種腔內纖維狀組織。這種纖維會螯合并聚集黑色素。這種纖 維的形成是黑素體生成過程中關鍵的一步。有研究表明黑素細胞中條紋狀纖維的形成有 賴于PMEL17蛋白的裂解。Kerje等研究發(fā)現(xiàn)顯性白羽雞PMEL17基因序列的第10外顯子 上的9bp插入突變是顯性白羽性狀形成的主要原因，插入突變導致該蛋白跨膜區(qū)多出3個 氨基酸，而使其編碼的蛋白跨膜域結構發(fā)生改變，從而阻礙了黑色素的沉著，這就導致了顯 性白羽性狀的形成。其所對應的等位基因為I，而隱性等位基因i不含該突變。對應的顯 性白羽雞的基因型為1-，有色羽或隱性白羽雞的基因型為ii。韓國首爾國立大學JINWON CHOI等利用等位基因特異性PCR技術對白來航、韓國Ogol雞和橫斑洛克雞的PMEL17基因 的突變位點進行了檢測，其中提供了兩對等位基因特異性引物檢測PMEL17基因的9bp突變 位點，這兩對引物的下游引物相同，設在突變位點之后，檢測顯性突變的上游引物設在突變 位點附近，其中3'末端4個堿基與9bp突變位點上的堿基相配對，檢測非顯性突變的上游 引物與檢測顯性突變的上游引物起始位點一致，但是3'末端4個堿基與9bp突變位點之后 緊挨的4個堿基相配對，該方法在做檢測時，每個樣本都需要用這兩對引物分別檢測，綜合 兩者結果才能準確判斷樣本的基因型。當樣本量加大，不僅檢測量翻倍，同時還會產生較多 的誤差，影響檢測效率。劉文博等利用混合樣本池法對不同雞的PMEL17基因突變位點進行 了檢測，驗證了在相同實驗條件下，PCR產物混合樣本池法的檢測精度高于DNA樣本混合池 法。該方法利用PAGE膠直接檢測9bp插入突變，能夠分辨不同的基因型，但PAGE膠配制過 程較瓊脂糖膠復雜很多，且具有更大的毒性，其存在電泳及銀染過程耗時較多，且穩(wěn)定性較 差、不易重復等弊端。
[0005] 如上所述，顯性白羽雞PMEL17基因的突變位點只有9bp堿基的插入，突變型和非 突變型基因的序列長度差異很小。目前已報道的檢測顯性白羽基因的方法中，不論是在 PMEL17基因突變位點前后設計引物然后擴增，再通過PAGE法進行鑒別；還是通過兩對等位 基因特異性引物對樣本的PMEL17基因突變位點進行檢測，都存在耗時較長，穩(wěn)定性差等問 題，不適用于育種中大量樣本的檢測。PCR-RFLP方法是基因型檢測中得到普遍公認的方法， 其特點是穩(wěn)定性好，可重復，適用于大規(guī)模樣品檢測，該方法的關鍵是找到或制造特異性的 酶切位點。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種雞顯性白羽基因的鑒定的方法。
[0007] 本發(fā)明提供了一對用于鑒定雞顯性白羽基因的引物對。
[0008] 本發(fā)明所提供的專用引物為由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成 的引物對。
[0009] 含有所述引物對的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0010] 為了方便檢測，所述試劑盒中還含有限制性內切酶BsrBI。
[0011] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述試劑盒中含有如下組分：所述引物對、所述限制性 內切酶BsrBI(NEB公司產品）、2XTaqPCRmasterMix(北京匯天東方科技有限公司，產 品編號HT201)、ddH20、10XNEBuffer(與所述限制性內切酶BsrBI配套使用的緩沖液，NEB 公司，產品編號#B7004S)、濃度為2. 5mM的Mg2+水溶液(如MgCl2)。
[0012] 所述引物對或所述試劑盒可用于鑒定或輔助鑒定待測雞的顯性白羽基因的基因 型；所述顯性白羽基因的基因型為如下三種中的任一種：
[0013] (al)II基因型：顯性白羽純合(表型白羽）；
[0014] (a2)Ii基因型：顯性白羽雜合(表型白羽）；
[0015] (a3)ii基因型：非顯性白羽純合(表型可為有色羽，也可為白羽）。
[0016] 所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017] 根據所述試劑盒中含有組分的不同，所述試劑盒的制備方法具體可包括如下（c) 或（d)的步驟：
[0018] (c)將所述引物對中的兩條單鏈DNA分別單獨包裝；
[0019] (d)將所述引物對中的兩條單鏈DNA和所述限制性內切酶BsrBI分別單獨包裝。
[0020] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定雞顯性白羽基因的基因型的方法，是檢測待測雞 的顯性白羽基因的基因型為如下三種中的哪一種：（al)II基因型：顯性白羽純合(表型白 羽），（a2)Ii基因型：顯性白羽雜合(表型白羽），（a3)ii基因型：非顯性白羽純合(表型可 為有色羽，也可為白羽），可為如下（A)或（B):
[0021] (A)具體可包括如下（A1)和（A2)的步驟：
[0022] (A1)以待測雞的基因組DNA為模板，用所述引物對(序列3和序列4)進行PCR擴 增，得到PCR產物；
[0023] (A2)用限制性內切酶BsrBI酶切步驟（A1)所得PCR產物，根據酶切結果按照如 下方法確定所述待測雞的顯性白羽基因的基因型：若酶切產物為184bp和42bp的兩個DNA 片段，則所述待測雞為或候選為II基因型；若酶切產物為184bp、42bp和217bp的三個DNA 片段，則所述待測雞為或候選為Ii基因型；若酶產物為217bp的一個DNA片段，則所述待測 雞為或候選為ii基因型。
[0024] (B)具體可包括如下步驟：
[0025] (B1)檢測待測雞的基因組DNA中是否含有序列表中序列1和序列2所不DNA片 段；
[0026] (B2)根據步驟（B1)的檢測結果按照如下方法確定所述待測雞的顯性白羽基因的 基因型：若所述待測雞的基因組DNA中含有序列2所示的DNA片段，同時不含有序列1所示 的DNA片段，則所述待測雞為或候選為II基因型；若所述待測雞的基因組DNA中同時含有 序列1和序列2所示的DNA片段，則所述待測雞為或候選為Ii基因型；若所述待測雞的基 因組DNA中含有序列1所示的DNA片段，同時不含有序列2所示的DNA片段，則所述待測雞 為或候選為ii基因型。
[0027] 在所述鑒定或輔助鑒定雞顯性白羽基因的基因型的方法中，（B)的步驟（B1)中，所 述"檢測待測雞的基因組DNA中是否含有序列表中序列1和序列2所示DNA片段"的方法 具體可為：以所述待測雞的基因組DNA為模板，用所述引物對(序列3和序列4)進行PCR擴 增，得到PCR產物，對PCR產物進行序列測定，若PCR產物的序列含有序列表中序列1，則所 述待測雞的基因組DNA中含有序列表中序列1所示DNA片段，若PCR產物的序列不含有序 列表中序列1，則所述待測雞的基因組DNA中不含有序列表中序列1所示DNA片段；若PCR 廣物的序列含有序列表中序列2,則所述待測雞的基因組DNA中含有序列表中序列2所不 DNA片段，若PCR產物的序列不含有序列表中序列2,則所述待測雞的基因組DNA中不含有 序列表中序列2所示DNA片段。
[0028] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種白羽雞的育種方法。
[0029] 本發(fā)明所提供的白羽雞的育種方法，是以如下雞為親本進行育種：經以上所述鑒 定或輔助鑒定雞顯性白羽基因的基因型的方法鑒定得到的II基因型的雞。
[0030] 在實際的育種工作中，加入顯性白羽純合個體（白來航個體）作為陽性對照樣本， 更有利于雞顯性白羽基因基因型的鑒定。
[0031] 以上所有的所述待測雞的基因組DNA均可來源于離體的雞組織器官或血液。
[0032] 以上所有的所述待測雞均可為任意雞，如白來航雞、壽光雞、隱性白雞和/或絲羽 烏骨雞。
[0033] 以上所有的所述II基因型為PMEL17基因的第10外顯子具有序列表中序列2所 示DNA片段的純合體；以上所有的所述ii基因型為PMEL17基因的第10外顯子具有序列表 中序列1所示DNA片段的純合體；以上所有的所述Ii基因型為它們的雜合體。
[0034] 實驗證明，利用本發(fā)明所提供的方法鑒定雞顯性白羽基因的基因型（II基因型或 Ii基因型或ii基因型)，具有如下優(yōu)點：操作簡單、檢測快速、結果準確、重復