BR綠(SYBR green)或分子信標(biāo)(Molecular Beacon)。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，可檢測探針是具有與靶序列互補(bǔ)的至少約10個核苷酸、可檢測部分、以及聚合酶捕獲分子的非可擴(kuò)增性、可檢測的多核苷酸探針，其中所述聚合酶捕獲分子防止聚合酶在另外支持聚合酶活性的條件下擴(kuò)增所述探針。
[0024]在本文描繪的任何方面的不同實施例中，測試樣品包含病原體。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，病原體是病毒、細(xì)菌、酵母或真菌。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，測試樣品是生物樣品。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，生物樣品是細(xì)胞、組織樣品、或生物流體(例如尿、精液、陰道分泌物、或糞便)。在本文描繪的任何方面的不同實施例中，測試樣品是環(huán)境樣品。
[0025]本發(fā)明提供了用于檢測使用NEAR反應(yīng)擴(kuò)增的靶核酸分子的組合物和方法。通過本發(fā)明定義的組合物和物品單獨地或者否則與下面提供的實例相關(guān)地進(jìn)行制造。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將從詳細(xì)描述并且從權(quán)利要求書中變得明顯。
[0026]定義
[0027]在本披露中，“包含(comprises)”、“包含(comprising) ”、“含有(containing)，，以及“具有(having) ”等可以具有美國專利法中向它們所賦予的含義，并且可以意指“包括(includes) ”、“包括(including) ” 等；“基本上由…組成(consisting essentially of)，，或“基本上由…組成(consists essentially) ”同樣具有美國專利法中所賦予的含義，并且所述術(shù)語是開放式的，允許超過所列舉的內(nèi)容的存在，只要所列舉的內(nèi)容的基礎(chǔ)或新穎特征不會因超過所列舉的內(nèi)容的存在而改變即可，但將現(xiàn)有技術(shù)實施例排除在外。
[0028]“聚合酶捕獲分子(polymerase-arresting molecule) ”是指與防止或顯著減少在多核苷酸模板上的聚合酶的進(jìn)展的多核苷酸模板/引物關(guān)聯(lián)的部分。優(yōu)選地，將所述部分并入所述多核苷酸。在一個優(yōu)選實施例中，所述部分防止聚合酶在所述模板上進(jìn)展。
[0029]“聚合酶延伸”是指聚合酶從易接近3’ -羥基向前進(jìn)展，摻入與模板多核苷酸鏈上的它們相對的核苷酸互補(bǔ)的進(jìn)入的單體。
[0030]“外切酶缺陷的聚合酶”是指沒有5’ -3’外切酶活性或具有幾乎不可檢測水平的此類活性的依賴DNA的DNA聚合酶和/或依賴于RNA的DNA聚合酶。
[0031]“核苷酸加合物”是指共價結(jié)合或以另外的方式固定至標(biāo)準(zhǔn)核苷酸堿基上的部分。
[0032]如在此使用，術(shù)語“可檢測的多核苷酸探針”是指用具有與靶序列的至少一個鏈互補(bǔ)的序列區(qū)的可檢測部分標(biāo)記的任何至少部分單鏈的多核苷酸，當(dāng)結(jié)合至靶序列時，所述可檢測的多核苷酸探針從所述可檢測部分釋放可檢測信號，而通過此可檢測部分的信號產(chǎn)生并不取決于由非特異性5’ -3’外切酶活性切割所述可檢測的多核苷酸探針。如在此使用，“可檢測的多核苷酸探針”的實例是，但不局限于，如現(xiàn)有技術(shù)描述的熒光分子信標(biāo)。
[0033]如在此使用，術(shù)語“核酸”是指脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或修飾的核苷酸、以及它們的單鏈或雙鏈形式的聚合物。所述術(shù)語涵蓋含有已知的核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或連接的核酸，這些核酸是合成的、天然存在的、及非天然存在的，具有類似于參照物核酸的相似結(jié)合特性，并以類似于參照物核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不局限于2’修飾的核糖核苷酸(例如2’ -O-甲基核糖核苷酸、2’ -F核苷酸)。
[0034]如在此使用，“修飾的核苷酸”是指具有對核苷、核堿基、戊糖環(huán)、或磷酸基團(tuán)的一個或更多個修飾的核苷酸。例如，修飾的核苷酸排除了包含一磷酸腺苷、一磷酸鳥苷、一磷酸尿苷、以及一磷酸胞苷的核糖核苷酸，以及包含一磷酸脫氧腺苷、一磷酸脫氧鳥苷、一磷酸脫氧胸苷、以及一磷酸脫氧胞苷的脫氧核糖核苷酸。修飾包括起因于通過修飾核苷酸的酶(例如甲基轉(zhuǎn)移酶)的修飾的天然發(fā)生的那些。修飾的核苷酸還包括合成的或非天然發(fā)生的核苷酸。核苷酸中合成的或非天然發(fā)生的修飾包括具有2’修飾的那些，這些2’修飾例如2’ -燒基，像2’-O-甲基和2 ' _甲氧基乙氧基、2' _氣代、2’-輕基(RNA)、2 ' _稀丙基、2' _0-[2_(甲基氛基)_2_氧代乙基]、4 ' _疏基、4' -CH2-0_2 ' _橋、4' -(CH2)2-O^r -橋、2' -LNA、以及2' _0_(N-氨基甲酸甲酯)或包含堿基類似物的那止匕
~、O
[0035]“堿基置換”是指并不引起互補(bǔ)核苷酸鏈之間的雜交的顯著破壞的核堿基多聚體的取代基。
[0036]“特異性產(chǎn)物”是指由模板寡核苷酸與互補(bǔ)的靶序列雜交以及靶序列的隨后的聚合酶介導(dǎo)的延伸產(chǎn)生的多核苷酸產(chǎn)物。
[0037]“切口和延伸擴(kuò)增反應(yīng)”是指導(dǎo)致感興趣的多核苷酸擴(kuò)增的切口和延伸的交替循環(huán)。
[0038]“基本上等溫條件”是指在單一溫度或在并不顯著變化的窄溫度范圍內(nèi)。在一個實施例中，在基本上等溫條件下進(jìn)行的反應(yīng)是僅變化約l°c -50C (例如變化1、2、3、4、或5度)的溫度下進(jìn)行。在另一實施例中，所述反應(yīng)是在所用儀器的操作參數(shù)內(nèi)的單一溫度下進(jìn)行。
[0039]“切口酶”是指多肽，所述多肽能夠識別并且結(jié)合雙鏈核酸分子中的特異性結(jié)構(gòu)，并且當(dāng)結(jié)合至其識別的特異性結(jié)構(gòu)時，打開單鏈上的鄰接核苷酸之間的磷酸二酯鍵，由此產(chǎn)生可以由外切酶缺陷的聚合酶延伸的、切口位點上游的末端核苷酸上的游離3’ -羥基。
[0040]“切口位點”是指由切口酶水解的雙鏈核酸分子的一個鏈中的“打開的”磷酸二酯鍵的位置。
[0041]“擴(kuò)增子”是指在感興趣的多核苷酸的擴(kuò)增期間，產(chǎn)生的一個多核苷酸或多個多核苷酸。在一個實例中，擴(kuò)增子是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間產(chǎn)生的。
[0042]“半定量的”是指基于內(nèi)部對照，提供相對量的估計。
[0043]“量閾值的方法”是指基于在量上超過抑或未超過比較標(biāo)準(zhǔn)，提供量的估計。
[0044]“擴(kuò)增速率改性劑”是指能夠影響聚合酶延伸的速率或由切口酶切口單鏈的速率，抑或這二者的試劑。
[0045]“監(jiān)測反應(yīng)”是指檢測反應(yīng)的進(jìn)展。在一個實施例中，監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)展涉及檢測聚合酶延伸和/或檢測完整的NEAR反應(yīng)。
[0046]“檢測”是指鑒定待檢測的分析物的存在、缺乏或者量。
[0047]“可檢測部分”是指組合物，當(dāng)把所述組合物連接至感興趣的分子時，使后者變成經(jīng)由光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、或化學(xué)的手段可檢測。例如，有用的標(biāo)記物包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠粒、熒光染料、高電子密度試劑、酶(例如，如通常在ELISA中所使用的)、生物素、異羥基洋地黃毒甙元、或半抗原。
[0048]“片段”是指核酸分子的一部分。所述部分包含，優(yōu)選地，參考核酸分子或多肽的整個長度的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或 90%。片段可以包含 5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或 100 個核苷酸。
[0049]“雜交”是指互補(bǔ)核堿基之間的氫鍵合，所述氫鍵合可以為沃森-克里克(Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏(reversed Hoogsteen)氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過氫鍵的形成進(jìn)行配對的互補(bǔ)核堿基。
[0050]“分離的多核苷酸”是指脫離了基因(這些基因在衍生出本發(fā)明的核酸分子的有機(jī)體的天然存在的基因組中)的核酸(例如，DNA)，插入所述基因側(cè)翼。因此所述術(shù)語包括，例如，重組DNA，所述重組DNA合并進(jìn)入載體、自主復(fù)制質(zhì)?；虿《?、或原核生物或真核生物的基因組DNA，或者所述重組DNA作為不依賴于其他序列的分離的分子存在(例如，通過PCR或限制性內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)生的cDNA或者基因組的或cDNA的片段)。此外，所述術(shù)語包括從DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA分子，以及是對另外的多肽序列進(jìn)行編碼的雜合基因的一部分的重組 DNA。
[0051]術(shù)語“分離的”、“純化的”或“生物純的”是指在不同程度上不含在其天然狀態(tài)中通常伴隨其的組分的材料?！胺蛛x”是指與原始來源或環(huán)境分開的程度。“純化”是指高于分離的分開的程度?！凹兓摹被颉吧锛兊摹钡鞍资浅浞值夭缓衅渌牧希@樣使得任何雜質(zhì)并不物質(zhì)上影響蛋白的生物學(xué)特性或引起其他不良后果。即，本發(fā)明的核酸或肽是純化的，前提是基本上不含有細(xì)胞材料、病毒材料、或培養(yǎng)基(通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時)或化學(xué)前體或其他化學(xué)品(化學(xué)合成時)。典型地使用分析化學(xué)技術(shù)，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來確定純度和同質(zhì)性。術(shù)語“純化的”可以指核酸或蛋白在電泳凝膠中實質(zhì)上產(chǎn)生了條帶。對于可以經(jīng)受修飾(例如磷酸化或糖基化)的蛋白而言，不同修飾可以產(chǎn)生不同的分離的蛋白，這些蛋白可以分開地純化。
[0052]如在此使用，如“獲得試劑”中的“獲得”包括合成、購買、或以另外的方式獲得所述試劑。
[0053]“參考”是指標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諚l件。如對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言明顯的是，適當(dāng)?shù)膮⒖际窃谠乇桓淖円源_定所述元素的影響的情況下。
[0054]“雜交”是指在嚴(yán)謹(jǐn)度的不同條件下，配對以形成互補(bǔ)多核苷酸序列(例如在此描述的基因)或它們的部分之間的雙鏈分子。(參見例如Wahl，G.M.(瓦爾)和S.L Berger (伯杰)(1987)Methods Enzymol.(酶學(xué)方法)152:399 ;Kimmel，A.R.(基梅爾)(1987)MethodsEnzymol.(酶學(xué)方法)152:507)。
[0055]“受試者”是指哺乳動物，包括但不局限于，人或非人類的哺乳動物，例如牛、馬、犬、綿羊、或貓。
[0056]“靶核酸分子”是指待分析的多核苷酸。此類多核苷酸可以是靶順序的有義鏈或反義鏈。術(shù)語“靶核酸分子”還指原始靶序列的擴(kuò)增子。
[0057]將在此提供的范圍理解為對所述范圍內(nèi)全部值的簡寫。例如，I到50的范圍應(yīng)當(dāng)理解為包括來自下組的任何數(shù)字、數(shù)字組合或子范圍，所述組由以下各項組成:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50。
[0058]除非明確聲明或從上下文明顯可見，如在此所使用，術(shù)語“或(or) ”被理解為包括在內(nèi)。除非明確聲明或從上下文明顯可見，如在此所使用，術(shù)語“一個、一種(a、an)”、和“所述(the)”被理解為單數(shù)的或復(fù)數(shù)的。
[0059]除非明確聲明或從上下文明顯可見，如在此所使用，術(shù)語“約”被理解為在本領(lǐng)域的正常容差范圍內(nèi)，例如，在平均數(shù)的2個標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)。約可以被理解為在聲明值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%,0.1%、0.05%、或 0.01%之內(nèi)。除非從上下文清晰可見，在此提供的所有數(shù)值被所述術(shù)語約修飾。
[0060]在此以變量的任意定義對化學(xué)基團(tuán)的清單的描述包括作為任意單獨基團(tuán)或所列基團(tuán)的組合的變量的定義。在此針對變量或方面的實施例的描述包括所述實施例作為任何單個的實施例或與任何其他實施例或其部分的組合。
[0061]在此提供的任何組合物或方法可以與在此提供的一個或更多個任何其他組合物和方法進(jìn)行組合。
[0062]附圖簡要說明
[0063]圖1描繪了示例性聚合酶捕獲實體結(jié)構(gòu)。黑色=穩(wěn)定子序列，藍(lán)色=切口酶識別序列，綠色=切口酶間隔子序列，紅色=靶-特異性識別序列，A =腺嘌呤，T =胸腺嘧啶，G=鳥嘌呤，C =胞嘧啶，U =尿嘧啶，mX = 2’ -O-甲基RNA堿基。加下劃線的一個或?qū)彾鄠€堿基描繪了修飾的序列區(qū)段。
[0064]圖2A-2C 描繪了對馬鈴薯環(huán)腐病菌(Clavibacter michiganensis sepidonicus)(Cms)革E DNA的動態(tài)范圍合成長聚物(long-mer)的評價。示出了來自Cms合成“長聚物”靶的滴定的示例性結(jié)果和經(jīng)由氟信標(biāo)的檢測。無靶核酸輸入而進(jìn)行的對Cms的NEAR測定被表示為無靶對照(NTC)。圖2A是示出在含2’ -O-甲基修飾的引物/模板的反應(yīng)中抑制無靶對照(NTC)中的信號的圖。圖2B是示出展示了使用2’ -O-甲基模板反應(yīng)的廣動態(tài)范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。圖2C是如與未修飾的引物/模板(左側(cè)小圖)進(jìn)行比較，示出使用2’-0_甲基修飾的引物/模板(右側(cè)小圖)的Cms測定系統(tǒng)的無靶對照(NTC)中非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的消除的示例性質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比較。為了確定2’-0_甲基修飾的引物/模板對背景產(chǎn)物的產(chǎn)生的影響，經(jīng)由HPLC/質(zhì)譜法分析圖2A中描繪的無靶對照反應(yīng)的樣品(10 μ I)。質(zhì)譜數(shù)據(jù)清晰地證明在2’ -O-甲基修飾的引物/模板存在下，檢測到只有預(yù)期的分子種類的存在，并且消除了在未修飾的引物/模板存在下產(chǎn)生的復(fù)雜背景產(chǎn)物。
[0065]圖3描繪了在使用SYBR綠檢測的NEAR測定中，模板/引物的2 ’ -O-甲基修飾消除了背景信號。示出了使用2’-0_甲基修飾的引物/模板的示例性擴(kuò)增數(shù)據(jù)和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的消除。圖3A是示出了在無靶