用于量化樣品中核酸序列的組合物和方法
【專利說明】用于量化樣品中核酸序列的組合物和方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2012年4月9日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/621，975的權(quán)益，所述申請(qǐng)通過引用以其全文結(jié)合在此。
[0003]發(fā)明背景
[0004]核酸擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)提供了理解復(fù)雜生物學(xué)過程，檢測、鑒定、和量化病原性和非病原性有機(jī)體，法醫(yī)犯罪學(xué)分析，疾病相關(guān)研宄，以及遺傳上修飾過的有機(jī)體中的事件的檢測等的手段。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是用于擴(kuò)增DNA的常用熱循環(huán)依賴性核酸擴(kuò)增技術(shù)，所述技術(shù)由多個(gè)循環(huán)的、用于DNA熔化和使用DNA聚合酶的DNA的酶復(fù)制的反應(yīng)的重復(fù)加熱和冷卻組成。實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)是用于量化生物樣品中給定核酸序列的拷貝數(shù)的技術(shù)。目前，qPCR利用了貫穿所述反應(yīng)的實(shí)時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物檢測，并且比較擴(kuò)增圖譜與在每個(gè)反應(yīng)開始時(shí)包含已知量的核酸(或核酸與未知的所測試的核酸的已知相對(duì)比率)的對(duì)照的擴(kuò)增。對(duì)照的結(jié)果用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，典型地基于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)擴(kuò)增曲線的對(duì)數(shù)部分?；谂c標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照量進(jìn)行比較的它們的擴(kuò)增曲線的情況，這些值用于插入未知物的量。
[0005]除了 PCR，現(xiàn)存的非熱循環(huán)依賴性擴(kuò)增系統(tǒng)或等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)包括但不局限于:切口和延伸擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增(LAMP)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、單引物等溫?cái)U(kuò)增(SPIA)、Q-f3復(fù)制酶系統(tǒng)、以及重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)。
[0006]NEAR擴(kuò)增具有與PRC熱循環(huán)的相似性。類似于PRC，NEAR擴(kuò)增采用與PCR中稱為引物并且在NEAR中稱為模板的靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列。此外，靶序列的NEAR擴(kuò)增導(dǎo)致靶序列的對(duì)數(shù)增長，就像它在標(biāo)準(zhǔn)PCR中的表現(xiàn)一樣。不像PCR，NEAR反應(yīng)是等溫地進(jìn)展。在標(biāo)準(zhǔn)PCR中，溫度是增加的，用來允許兩個(gè)DNA鏈分開。在NEAR反應(yīng)中，靶核酸序列在測試樣品中存在的特異性切口位點(diǎn)處是切口的。聚合酶滲入切口位點(diǎn)并且與現(xiàn)存互補(bǔ)DNA鏈的置換一起開始切口的靶核苷酸序列(添加的外源DNA)的互補(bǔ)鏈合成。鏈置換復(fù)制過程排除了對(duì)增加的溫度的需求。此時(shí)，模板/引物分子從添加的外源DNA退火成置換的互補(bǔ)序列。聚合酶現(xiàn)在從模板的3’端延伸，產(chǎn)生先前置換的鏈的互補(bǔ)鏈。然后第二模板/引物寡核苷酸退火成新合成的互補(bǔ)鏈并且延伸，制成包括切口酶識(shí)別序列的NDA的雙鏈體。所述鏈然后傾向于被切口，伴隨通過聚合酶的隨后的鏈置換延伸，這導(dǎo)致在原有革E DNA的任一側(cè)上具有切口位點(diǎn)的DNA的雙鏈體的產(chǎn)生。一旦這被合成，繼續(xù)通過置換的鏈與新模板分子一起的復(fù)制指數(shù)地?cái)U(kuò)增所述分子。此外，還通過在模板引入的切口位點(diǎn)的切口翻譯合成的重復(fù)動(dòng)作，擴(kuò)增從每個(gè)產(chǎn)物分子線性地繼續(xù)進(jìn)行。結(jié)果是靶信號(hào)擴(kuò)增的非常迅速的增長；與PCR熱循環(huán)相比，遠(yuǎn)遠(yuǎn)更快，其中擴(kuò)增導(dǎo)致小于十分鐘。
[0007]然而，量化已經(jīng)成了問題。實(shí)時(shí)NEAR系統(tǒng)的最佳性能取決于特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生和擴(kuò)增。已知除了通過反應(yīng)酶的特異性產(chǎn)物，NEAR系統(tǒng)產(chǎn)生顯著水平的非特異性背景產(chǎn)物。這些背景產(chǎn)物可以用作可擴(kuò)增實(shí)體，并且它們的產(chǎn)生會(huì)勝過特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。雖然可能設(shè)計(jì)特異性針對(duì)希望的靶的檢測探針(并且因此在復(fù)雜背景中，特異性產(chǎn)物是可檢測的)，但是顯著水平的非特異性背景產(chǎn)物隔離了可能已經(jīng)另外用于特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增的反應(yīng)組分。因此，由于非特異性背景產(chǎn)物產(chǎn)生引起的反應(yīng)組分隔離導(dǎo)致次優(yōu)的反應(yīng)。當(dāng)靶核酸最初處于非常低的豐度時(shí)，并且在靶的可靠檢測需要高度優(yōu)化的反應(yīng)的情況下，這是特別麻煩的。而且，次優(yōu)的反應(yīng)不會(huì)表示靶核酸的真實(shí)量化，即使它是可檢測的。會(huì)有利的是，產(chǎn)生消除非特異性背景產(chǎn)物的擴(kuò)增的優(yōu)化的NEAR反應(yīng)。這樣做會(huì)通過基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的系統(tǒng)抑或相對(duì)量化，提供適合量化的反應(yīng)。
[0008]而且，通常的做法是使用質(zhì)譜法來評(píng)價(jià)NEAR反應(yīng)。高水平的背景產(chǎn)物會(huì)模糊質(zhì)譜法數(shù)據(jù)的判讀。例如，如果反應(yīng)包含背景產(chǎn)物、源自非特異性擴(kuò)增(來自仍相關(guān)的不相似的靶)的一種或更多種產(chǎn)物、以及特異性產(chǎn)物，則從背景產(chǎn)物鑒定這些基質(zhì)衍生的產(chǎn)物將是挑戰(zhàn)性的。背景產(chǎn)物的消除導(dǎo)致具體測定的性能/特異性的清晰確定。
[0009]額外地，高水平的背景產(chǎn)物會(huì)阻礙有意的雙重或多重反應(yīng)的最佳擴(kuò)增。雖然多重的、差異化標(biāo)記的檢測探針是與實(shí)時(shí)檢測相容的，但是由于非特異性產(chǎn)物形成，仍存在反應(yīng)物限制的問題。對(duì)于雙重或多重反應(yīng)而言，這是特別真實(shí)的，其中這些反應(yīng)包含可以潛在地形成背景產(chǎn)物的復(fù)雜群體的多于兩種的模板/引物。消除了背景產(chǎn)物的擴(kuò)增的NEAR反應(yīng)系統(tǒng)還提供了用于實(shí)時(shí)檢測有意的雙重或多重反應(yīng)的條件。會(huì)高度有利的是，提供了用來消除可擴(kuò)增背景產(chǎn)物的手段，因此使NEAR反應(yīng)中產(chǎn)生特異性產(chǎn)物的潛能最大化。會(huì)希望的是，是否可以通過反應(yīng)進(jìn)展的實(shí)時(shí)準(zhǔn)確監(jiān)測，提供定量結(jié)果。
[0010]發(fā)明概述
[0011]如以下描述，本發(fā)明特征在于用于實(shí)時(shí)檢測樣品中的靶寡核苷酸的組合物和方法，所述方法減少或消除了背景產(chǎn)物的產(chǎn)生，以允許所述樣品靶寡核苷酸的量化。這些方法是與使用NEAR反應(yīng)擴(kuò)增靶寡核苷酸相容的。本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn):在單重NEAR反應(yīng)中可以產(chǎn)生特異性產(chǎn)物，而不產(chǎn)生背景產(chǎn)物。這些反應(yīng)組合物和方法提供了未知測試樣品、雙重反應(yīng)、以及多重反應(yīng)的相對(duì)量化，以及用于未知測試樣品的絕對(duì)量化的標(biāo)準(zhǔn)曲線的產(chǎn)生。
[0012]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了量化切口和延伸擴(kuò)增反應(yīng)中特異性產(chǎn)物的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個(gè)特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補(bǔ)序列)、切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個(gè)引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補(bǔ)的序列中具有一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有至少一部分所述靶核酸分子的多個(gè)擴(kuò)增子；并且檢測特異性針對(duì)與所述靶核酸分子或其擴(kuò)增子雜交的寡核苷酸探針的信號(hào)，其中所述信號(hào)表明在所述樣品中存在的靶核酸分子或其擴(kuò)增子的量。
[0013]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測在單個(gè)反應(yīng)的過程中產(chǎn)生的多種不同反應(yīng)產(chǎn)物的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個(gè)特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補(bǔ)序列)、切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個(gè)引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補(bǔ)的序列中具有一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有至少一部分所述靶核酸分子的多個(gè)擴(kuò)增子；并且檢測特異性針對(duì)與所述靶核酸分子或其擴(kuò)增子雜交的寡核苷酸探針的信號(hào)，其中所述信號(hào)表明在所述樣品中存在的靶核酸分子或其擴(kuò)增子的量。
[0014]在一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供了量化切口和延伸擴(kuò)增反應(yīng)中特異性產(chǎn)物的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種引物/模板寡核苷酸(其中每一個(gè)特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補(bǔ)序列)、切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個(gè)引物/模板寡核苷酸具有定位在與所述靶核酸分子互補(bǔ)的序列的3’端(例如所述寡核苷酸的3’末端)或其附近的至少約5個(gè)連續(xù)的2’-0_甲基修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有至少一部分所述靶核酸分子的多個(gè)擴(kuò)增子；并且檢測特異性針對(duì)與所述靶核酸分子或其擴(kuò)增子雜交的寡核苷酸探針的信號(hào)，其中所述信號(hào)表明在所述樣品中存在的靶核酸分子或其擴(kuò)增子的量。
[0015]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于實(shí)時(shí)監(jiān)測切口和延伸擴(kuò)增反應(yīng)的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使測試樣品與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個(gè)特異性結(jié)合靶核酸分子上的互補(bǔ)序列)、切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個(gè)引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補(bǔ)的序列中具有一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有至少一部分所述靶核酸分子的多個(gè)擴(kuò)增子；并且實(shí)時(shí)檢測信號(hào)，由此量化所述一個(gè)或更多個(gè)靶核酸分子。
[0016]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于實(shí)時(shí)監(jiān)測NEAR反應(yīng)中靶核酸分子的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:外切酶缺陷的聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個(gè)特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補(bǔ)序列)、切口酶、異源雙鏈特異性的切口酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個(gè)引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補(bǔ)的序列中具有一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有結(jié)合所述可檢測寡核苷酸探針的靶序列的多個(gè)擴(kuò)增子；并且實(shí)時(shí)檢測信號(hào)，由此量化所述靶核酸分子。
[0017]仍在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于實(shí)時(shí)監(jiān)測測試樣品中靶核酸分子的方法，所述方法涉及:在基本上等溫條件下，使靶核酸分子與以下接觸:聚合酶、兩種或更多種引物/模板寡核苷酸(其中每一個(gè)特異性結(jié)合所述靶核酸分子上的互補(bǔ)序列)、切口酶、修復(fù)酶或校正讀碼酶、以及可檢測的多核苷酸探針，其中每個(gè)引物/模板寡核苷酸在與所述靶核酸分子互補(bǔ)的序列中具有一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸；產(chǎn)生具有結(jié)合所述可檢測寡核苷酸探針的靶序列的多個(gè)擴(kuò)增子；并且實(shí)時(shí)檢測信號(hào)，由此量化所述靶核酸分子。
[0018]仍在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測NEAR反應(yīng)中的靶序列的試劑盒，所述試劑盒包含一個(gè)或更多個(gè)引物/模板寡核苷酸，以及用于本發(fā)明的方法中的引物/模板寡核苷酸的用途的說明書，這個(gè)或這些引物/模板寡核苷酸特異性結(jié)合靶核酸分子上的互補(bǔ)序列并且在與所述靶核酸分子互補(bǔ)的序列中具有一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸。
[0019]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供給了從5’至3’，具有第一區(qū)和第二區(qū)的分離的寡核苷酸，其中所述第一區(qū)具有切口酶識(shí)別序列；其中所述第二區(qū)具有特異性結(jié)合靶核酸分子上的互補(bǔ)序列的至少9個(gè)或更多個(gè)核苷酸(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸)；并且其中所述第二區(qū)具有一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸。在其他實(shí)施例中，所述分離的寡核苷酸是列出于圖1中的那個(gè)。
[0020]在本文描繪的多個(gè)方面的不同實(shí)施例中，寡核苷酸(例如引物/模板寡核苷酸、分離的寡核苷酸)包含修飾的核苷酸，包括2’修飾的核苷酸。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，2’修飾是以下中的一個(gè)或更多個(gè):2’ -O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2 ' _氟代、2’-輕基、2'-稀丙基、2' -0-[2_ (甲基氨基)-2-氧代乙基]、4 '-疏基、4' -CH2-0-2'-橋、4' -(CH2)2-O^r -橋、2' _LNA、2’-烷基、以及'-0_(N-氨基甲酸甲酯)或修飾的核苷酸包含堿基類似物。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸定位在與靶核酸分子互補(bǔ)的序列的3’端(例如寡核苷酸的3’末端)或其附近。在本文描繪的任何方面的其他實(shí)施例中，一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸定位在與靶核酸分子互補(bǔ)的序列的5’端。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，定位在與靶核酸分子互補(bǔ)的序列的5’端的一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸與切口位點(diǎn)隔開1、2、3、4、5或更多個(gè)未修飾的核苷酸。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，兩個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸是連續(xù)的(2、3、4、5、或更多個(gè))。在本文描繪的任何方面的其他實(shí)施例中，兩個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸是與未修飾的核苷酸交替的。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，切口酶識(shí)別序列是5’ -GAGTC-3’。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，5個(gè)連續(xù)的2’ -O-甲基修飾的核苷酸定位在與靶核酸分子互補(bǔ)的序列的3’端(例如寡核苷酸的3’末端)或其附近。在本文描繪的任何方面的其他實(shí)施例中，5個(gè)連續(xù)的2’ -O-甲基修飾的核苷酸定位在與靶核酸分子互補(bǔ)的序列的5’端。在本文描繪的任何方面的其他實(shí)施例中，與未修飾的核苷酸交替的2個(gè)或多個(gè)2’ -O-甲基修飾的核苷酸定位在與革El核酸分子互補(bǔ)的序列的5’端(即靶特異性區(qū)域)。
[0021]在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，檢測步驟并不檢測非靶分子的擴(kuò)增子。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，所述方法是實(shí)時(shí)進(jìn)行的。在本文描繪的任何方面的某些實(shí)施例中，產(chǎn)生多個(gè)擴(kuò)增子的步驟是實(shí)時(shí)進(jìn)行的(例如用來確定存在于反應(yīng)中的靶的量)。
[0022]在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，所述方法提供了確定在擴(kuò)增前，生物樣品中存在的核酸分子的量的半定量的和/或量閾值的方法。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，將一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸定位為更接近在與靶核酸分子互補(bǔ)的序列的5’端增加了擴(kuò)增的檢測時(shí)間。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步涉及使用引物/模板寡核苷酸的比率，來提供由不同量的起始靶材料引起的反應(yīng)產(chǎn)物的增加的分辨率。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，增加在識(shí)別序列的3’端具有一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸的引物/模板寡核苷酸與在識(shí)別序列的5’端具有一個(gè)或更多個(gè)2’修飾的核苷酸的引物/模板寡核苷酸的比率收縮了信號(hào)曲線并且移位了曲線的斜率。
[0023]在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步涉及使用擴(kuò)增速率改性劑，來提供由于不同量的起始靶材料引起的反應(yīng)產(chǎn)物的增加的分辨率。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，革El核酸分子是DNA或RNA核酸分子。在本文描繪的任何方面的不同實(shí)施例中，可檢測探針是SY