兩階段熱對流裝置及其用圖
【專利說明】
[OOOU 本申請是申請日為2011年1月11日、申請?zhí)枮?201180013705. 1"、發(fā)明名稱 為"兩階段熱對流裝置及其用途"的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請PCT/ IB2011/050104的中國國家階段申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求于2010年1月12日提交的美國臨時申請No. 61/294, 446的優(yōu)先權(quán)， 其公開內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明的特征是多階段熱對流裝置（特別是兩階段熱對流裝置）及其用途。所 述裝置包含至少一個輔助聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)的溫度成形元件（temperature shaping element)。本發(fā)明有多種應(yīng)用，包括在無需與現(xiàn)有設(shè)備相關(guān)的笨重且通常昂貴的硬件的情 況下擴增DNA模板。在一個實施方案中，該裝置可W放于使用者手掌上用作便攜式PCR擴 增設(shè)備。
【背景技術(shù)】
[0005] 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)是在每次溫度變化循環(huán)完成時擴增多核巧酸序列的技 術(shù)。參見例如，PCR;A Practical A卵roach，M.J.McPherson 等，1化 Press(1991) ;PCR Protocols ；A Guide to Methods andApplications，Innis 等，Academic Press (1990)郝 PCR Technology ；Principals and Applications for DNA Amplification，比 A.Erlich， Stockton Press (1989)。在許多專利（包括美國專利 No. 4, 683, 195、4, 683, 202、 4, 800, 159、4, 965, 188、4, 889, 818、5, 075, 216、5, 079, 352、5, 104, 792、5, 023, 171、 5, 091，310 和 5, 066, 584)中也描述了 PCR。
[0006] 在許多應(yīng)用中，PCR設(shè)及使目的多核巧酸（"模板"）變性，然后使期望的引物寡核 巧酸（"引物"）與變性的模板退火。退火之后，聚合酶催化合成新多核巧酸鏈，其包含引 物并且對其進行延伸。該一系列的步驟（變性、引物退火和引物延伸）構(gòu)成一個PCR循環(huán)。 該些步驟在PCR擴增過程中重復(fù)多次。
[0007] 隨著循環(huán)的重復(fù)，新合成的多核巧酸的量W幾何級數(shù)增加。在許多實施方案中，引 物是成對選擇的，它們可W與給定雙鏈多核巧酸的相對鏈退火。在該種情況下，可W擴增兩 個退火位置之間的區(qū)域。
[0008] 需要多在多循環(huán)PCR實驗中改變反應(yīng)混合物的溫度。例如，DNA變性通常在約90°C 至約98°C或更高的溫度下發(fā)生，引物與變性DM的退火通常在約45°C至約65°C下進行，而 用聚合酶延伸退火引物的步驟通常在約65°C至約75°C下進行。為了使PCR W最佳狀態(tài)進 行，該些溫度步驟必須被依次重復(fù)。
[0009] 為了滿足該需要，已開發(fā)多種市售設(shè)備用于進行PCR。許多設(shè)備的重要組件是熱 "循環(huán)儀"，其中的一個或更多個溫度控制元件（有時稱為"加熱塊"）容納PCR樣品。在一 段時間中加熱塊的溫度變化W支持熱循環(huán)。遺憾的是，該些設(shè)備有重大缺點。
[0010] 例如，大多數(shù)設(shè)備是巨大、笨重且通常昂貴的。通常需要大量電力來加熱和冷卻加 熱塊W支持熱循環(huán)。使用者常常需要接受大量培訓(xùn)。因此，該些設(shè)備一般不適于現(xiàn)場使用。
[0011] 克服該些問題的嘗試并不是完全成功的。例如，一種嘗試設(shè)及使用多個溫度控制 加熱塊，其中每個塊保持在期望的溫度并且使樣品在加熱塊之間移動。但是，該些裝置有其 他缺點，如需要復(fù)雜的機械裝置使樣品在不同加熱塊之間移動，W及需要一次加熱或冷卻 一個或幾個加熱塊。
[001引已有一些在一些PCR過程中使用熱對流的嘗試。參見Krishnan，M.等.（2002) Science 298 ;793 ;Wheeler，E. K. (2004) Anal. Chem. 76 ;4011-4016 ;化aim, D. (2004) Modern Physics Letters 18:775-784;和 W002/072267。但是，該些嘗試都沒有生產(chǎn)出小 型、便攜、更實惠，而且減少對電力的大量需求的熱對流PCR設(shè)備。而且，該些熱對流裝置往 往有低的PCR擴增效率和擴增子尺寸的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供了多階段熱對流裝置（特別是兩階段熱對流裝置）及其用途。該裝置 通常包含至少一個輔助聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)的溫度成形元件。如下文所述，典型的溫度 成形元件是該裝置中支持熱對流PCR的結(jié)構(gòu)和/或位置特征。溫度成形元件的存在增加 PCR擴增的效率和速度、支持小型化、并且減少對大量電力的需要。在一個實施方案中，該裝 置容易地放于使用者手掌上并且具有電池足W運行的低電力需求。在該實施方案中，該裝 置比許多現(xiàn)有PCR設(shè)備更小、更便宜且更便攜。
[0014] 因此，在一方面，本發(fā)明的特征是適于進行熱對流PCR擴增的兩階段熱對流裝置 ("裝置"）。優(yōu)選地，該裝置具有至少一個（優(yōu)選所有的）作為可操作連接組件的下述元 件：
[0015] (a)用于對槽進行加熱或冷卻并且包含上表面和下表面的第一熱源，所述槽適于 容納進行PCR的反應(yīng)容器，
[0016] 化）用于對所述槽進行加熱或冷卻并且包含上表面和下表面的第二熱源，所述下 表面朝向第一熱源的上表面，其中所述槽由接觸第一熱源的底端和與第二熱源的上表面鄰 接的通孔限定，并且其中底端與通孔的中屯、點之間形成槽軸，圍繞其布置所述槽，
[0017] (C)至少一個適于輔助熱對流PCR的溫度成形元件；W及
[0018] (d)在第一熱源內(nèi)適于容納所述槽的接收孔。
[0019] 還提供了制造上述裝置的方法，該方法包括W足W進行本文所述熱對流PCR的可 操作組合組裝（a)-(d)中的每個。
[0020] 在本發(fā)明的另一方面中，提供了適于使用至少一種本文所述裝置進行PCR的熱對 流PCR離屯、機（叩CR離屯、機"）。
[0021] 本發(fā)明還提供了通過熱對流進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)的方法。在一個實施方案 中，該方法包括至少一個（優(yōu)選所有的）下述步驟：
[0022] (a)將包含接收孔的第一熱源維持在適于使雙鏈核酸分子變性并形成單鏈模板的 溫度范圍內(nèi)，
[0023] 化）將第二熱源維持在適于使至少一條寡核巧酸引物與單鏈模板退火的溫度范圍 內(nèi)，W及
[0024] (c)在足W產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物的條件下在接收孔和第二熱源之間產(chǎn)生熱對流。
[0025] 另一方面，本發(fā)明提供了適于被本發(fā)明裝置容納的反應(yīng)容器。
【附圖說明】
[0026] 圖1為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案的俯視圖。示出了穿過裝置的剖面 (A-A 和 B-B)。
[0027] 圖2A至C為示意圖，其顯示具有第一室100的裝置的一個實施方案的剖面圖。圖 2A至C為沿A-A面（圖2A、2B)和B-B面（圖2C)的橫截面圖。
[002引圖3A至B為示意圖，其顯示裝置的一些實施方案沿A-A面的剖面圖。每個裝置具 有相對于槽軸80寬度不等的第一室100和第二室110。
[0029] 圖4A至B為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案的剖面圖（A-A)。圖4B顯示區(qū)域 (由圖4A中的虛線圓確定）的放大圖。裝置具有第一室100和第二室110。第一室與第二 室之間的區(qū)域包含第一熱制動器130。
[0030] 圖5A至C為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案的剖面圖。圖5A至C為沿A-A面 (圖5A至B)和B-B面（圖5C)的截面圖。第二熱源30包含第一室100和圍繞槽軸80對 稱布置并且延伸了第一室100的長度的第一突出部33。第一熱源20包含第一突出部23。 [003U 圖6A至C為沿A-A面（圖6A至B)和B-B面（圖6C)的裝置的一個實施方案的 示意圖。第一熱源20和第二熱源30包含突出部（23、24、33、34)，它們各自圍繞槽軸80對 稱布置。第二熱源30包含第一室100。
[0032] 圖7A至D為示意圖，其顯示裝置的槽的一些實施方案（A-A面）。
[0033] 圖8A至J為示意圖，其顯示裝置的槽的一些實施方案。剖面與槽軸80垂直。
[0034] 圖9A至I為圖示，其顯示裝置的多種室的一些實施方案。剖面與槽軸80垂直。陰 影線部分表示第二或第一熱源。
[0035] 圖10A至P為圖示，其顯示裝置的多種室和槽的一些實施方案。剖面與槽軸80垂 直。陰影線部分表示第二或第一熱源。
[0036] 圖11A至B為示意圖，其顯示多種定位實施方案。圖11A顯示圖5A所示裝置的定 位實施方案。裝置相對于重力方向傾斜（傾斜0g確定的角度）。
[0037] 圖11B顯示裝置的一個實施方案，其中在第二熱源30中槽70和第一室100相對 于重力方向傾斜。重力方向相對于熱源保持垂直。
[003引圖12A至B為示意圖，其顯示裝置的一些實施方案的剖面圖（A-A面）。第一室100 為錐形。
[0039] 圖13A至B是示意圖，其顯示裝置的一個實施方案的剖面圖（A-A面），該裝置實施 方案具有在第二熱源30內(nèi)位于第一室100與第二室110之間的第一熱制動器130。顯示的 第一和第二室的寬度不同。圖13B顯示由圖13A中所示虛線圓所確定之區(qū)域的放大圖，用 W說明第一熱制動器130的結(jié)構(gòu)細節(jié)。
[0040] 圖14A至D是示意圖，其顯示裝置的一些實施方案的剖面圖（A-A面），該裝置實施 方案具有位于第一室100的底部（即，第二熱源30的底部）的第一熱制動器130。圖14B 和D顯示了分別由圖14A和D中所示虛線圓所確定之區(qū)域的放大圖，用W說明第一熱制動 器130的結(jié)構(gòu)細節(jié)。在圖14A至B中第一室100具有直壁，在圖14C至D中具有錐形壁。
[0041] 圖15為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案的剖面圖（A-A)。接收孔73圍繞槽軸 80不對稱布置并形成接收孔間隙74。
[0042] 圖16A至B為示意圖，其顯示裝置的一些實施方案沿A-A面的剖面圖。第一熱源 20包含接收孔間隙74。在由圖16B所示的實施方案中，接收孔間隙74包含相對于槽軸80 傾斜的上表面。
[0043] 圖17A至B為示意圖，其顯示裝置的一些實施方案沿A-A面的剖面圖。第一熱源 20的特征為突出部23圍繞接收孔73不對稱布置。在圖17A中，與接收孔73相鄰的突出部 23具有多個上表面，其中之一更高并且更接近第一室100。在圖17B中，突出部23具有一 個相對于槽軸80傾斜的上表面，從而使一側(cè)與相對于接收孔73的另一側(cè)相比更高且更接 近第一室100。
[0044] 圖18A至D為示意圖，其顯示裝置的一些實施方案沿A-A面的剖面圖。在該些實 施方案中，第一熱源20和第二熱源30的特征為突出部23和33圍繞槽軸80不對稱布置。 突出部23和33的一側(cè)與相對于槽軸80的另一側(cè)相比更高。突出部23的頂端和突出部33 的底端具有多個表面（圖18A和18C)或相對于槽軸80傾斜（圖18B和18D)。在圖18A和 18B中，第一室100的特征為底端102,其一部分與相對于槽軸80的另一部分相比更接近突 出部23的一側(cè)。在圖18C和18D中，第一室100的底端102與突出部23上表面的距離基 本恒定。
[0045] 圖19A至B為示意圖，其顯示裝置的一些實施方案沿A-A面的剖面圖。在該些實 施方案中，第一熱源20的特征為突出部23圍繞接收孔73對稱布置，第二熱源30的特征為 突出部33圍繞槽軸80不對稱布置。在圖19A中，第一室100的底端102的特征為具有多 個表面，從而使底端102 -側(cè)的一部分比與槽軸80相對的另一部分更接近突出部23。在圖 19B中，第一室100的底端102相對于槽軸80傾斜，從而使底端102的一部分比與槽軸80 相對的另一部分更接近突出部23。
[0046] 圖20A至C為顯示多種裝置實施方案的示意圖。圖20A顯示裝置的一個實施方案 的剖面圖，其中第一室100在第二熱源30內(nèi)并且圍繞槽70不對稱（偏離中屯、）布置。圖 20B至C顯示沿A-A面的裝置的一個實施方案的剖面圖。第一室100圍繞槽70不對稱布 置。如圖20C所示，顯示熱制動器130圍繞槽70不對稱布置并且壁133接觸槽70的一側(cè)。
[0047] 圖21為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其顯示在第二熱 源30內(nèi)，第一室100和第二室110圍繞槽軸80不對稱布置。
[0048] 圖22為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室100 包含相對于槽軸80 W-定角度布置的壁103。
[0049] 圖23A至B為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第二熱 源30內(nèi)有第一室100和第二室110。如圖23B所示，該裝置的特征為第一熱制動器130圍 繞槽70不對稱布置且處于第一室100和第二室110之間，其壁133接觸槽70的一側(cè)。 [0化0] 圖24A至B為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)。第一室100和第二室110圍繞槽軸80不對稱布置。在 圖24B所示的放大圖中，顯示熱制動器130圍繞槽70對稱布置在第一室100和第二室110 之間。熱制動器130的壁133接觸槽70。
[0化1] 圖24C至D為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)。第一室100和第二室110圍繞槽軸80不對稱布置。 第一室100垂直于槽軸80的寬度小于第二室110沿槽軸80的寬度。在圖24D所示的放大 圖中，顯示第一熱制動器130圍繞槽70不對稱布置并且壁133接觸槽70的一側(cè)。
[0052] 圖25A至B為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)。第一室100和第二室110沿A-A面W相反方向圍繞槽 軸80不對稱布置。顯示熱制動器130圍繞槽70對稱布置并且壁133接觸槽70。
[0化3] 圖26A至B為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)。第一室100和第二室110圍繞槽軸80不對稱布置。 如圖26B所示，第一熱制動器130也圍繞槽70不對稱布置并且壁133接觸槽70的一側(cè)。 [0化4] 圖26C至D為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)并且圍繞槽軸80不對稱布置。如圖2抓所示，第一熱制 動器130也圍繞槽70不對稱布置并且壁133接觸槽70的一側(cè)。
[0化5] 圖27A至B為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)并且沿A-A面W相反方向圍繞槽軸80不對稱布置。在 圖27B所示的放大圖中，顯示在第一室100中，第一熱制動器130不對稱布置并且壁133接 觸槽70的一側(cè)。還顯示在第二室110中，第二熱制動器140不對稱布置并且壁143接觸槽 70的一側(cè)。第一熱制動器130的頂端131基本位于與第二熱制動器140的底端142相同的 高度。
[0化6] 圖27C至D為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)并且沿A-A面W相反方向圍繞槽軸80不對稱布置。在 圖27D所示的放大圖中，顯示第一熱制動器130和第二熱制動器140不對稱布置并且其壁 (133、143)各自接觸槽70的一側(cè)。第一熱制動器130頂端131所處的位置高于第二熱制動 器140的底端142。
[0化7] 圖27E至F為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)并且沿A-A面W相反方向圍繞槽軸80不對稱布置。在 圖27F所示的放大圖中，顯示第一熱制動器130和第二熱制動器140不對稱布置并且其壁 (133、143)各自接觸槽70的一側(cè)。顯示第一熱制動器130頂端131所處的位置低于第二熱 制動器140的底端142。
[0化引圖28A至B為示意圖，其顯示裝置的一個實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)并且圍繞槽軸80不對稱布置。第一室100的頂端101 和第二室110的底端112相對于槽軸80傾斜。第一室100的壁103和第二室110的壁113 各自與槽軸80基本平行。在圖28B所示的放大圖中，顯示第一熱制動器130相對于槽軸80 傾斜并且壁133接觸槽70。
[0化9] 圖29A至D為示意圖，其顯示裝置的一些實施方案沿A-A面的剖面圖，其中第一室 100和第二室110在第二熱源30內(nèi)并且圍繞槽軸80不對稱布置。在圖29A至D中，顯示 第一室100的壁103和第二室110的壁113相對于槽軸80傾斜。在圖29B所示的放大圖 中，顯示熱制動器130圍繞槽70對稱布置并且壁133與槽70接觸。在圖29D所示的放大 圖中，顯示第一熱制動器130相對于槽軸80傾斜并且壁133接觸槽70。
[0060] 圖30為示意圖，其顯示裝置10的一個實施方案的俯視圖，顯示第一固定元件200、 第二固定元件210、加熱/冷卻元件（160a至b)和溫度傳感器（170a至b)。指示了多個剖 面（A-A、B-B 和 C-C)。
[0061 ] 圖31A至B為示意圖，其顯示圖30所示的裝置實施方案沿A-A (圖31A)和B-B (圖 31B)面的截面圖。
[0062] 圖32為第一固定元件200沿C-C面的截面圖的示意圖。
[0063] 圖33為裝置一個實施方案的俯視圖的示意圖，其顯示多個固定元件、熱源結(jié)構(gòu)、 加熱/冷卻元件和溫度傳感器。
[0064] 圖34A至B為裝置一個實施方案的俯視圖（圖34A)和截面圖（圖34B)的示意圖， 顯示第一殼體元件300,其限定出第二絕熱體310和第=絕熱體320。
[00化]圖35A至B為裝置一個實施方案的俯視圖（圖35A)和截面圖（圖35B)的示意圖， 其包含第二殼體元件400和第四絕熱體410及第五絕熱體420。
[0066] 圖36A至B為一個PCR離屯、機的一個實施方案的示意圖。圖36A顯示俯視圖，圖 3她顯示沿A-A面的截面圖。
[0067] 圖37為示意圖，其顯示PCR離屯、機裝置的一個實施方案沿A-A面的截面圖。
[0068] 圖38A至B為示意圖，其顯示包含第一室的PCR離屯、機的實施方案。在圖38A中， 沿A-A的剖面穿過槽70。在圖38B中，沿B-B的剖面穿過第一固定工具200和第二固定工 具 210。
[0069] 圖39A至B為示意圖，其顯示用于圖38A至B所示PCR離屯、機的第一熱源（圖39A) 和第二熱源（圖39B)的一些實施方案。指示了穿過裝置的剖面（A-A和B-B)。
[0070] 圖40A至D為不意圖，其顯不多種反應(yīng)容器實施方案的截面圖。
[0071] 圖41A至J為示意圖，其顯示多種反應(yīng)容器實施方案垂直于反應(yīng)容器軸95的截面 圖。
[007引圖42A至C為使用圖5A的裝置進行熱對流PCR的結(jié)果，其顯示用使用分別來自 Takara Bio、Finnzymes和Kapa Biosystems的3種不同DNA聚合酶擴增來自Ing質(zhì)粒樣 品的349bp序列。
[0073] 圖43顯示使用圖5A的裝置進行熱對流PCR的結(jié)果，其顯示來自Ing質(zhì)粒樣品的 936bp序列的擴增。
[0074] 圖44A至D為使用圖5A的裝置進行熱對流PCR的結(jié)果，其顯示在提高的變性溫度 (分別為98°C、100°C、102°C和104°C )下PCR擴增加速。
[0075] 圖45A至B為使用圖5A的裝置進行熱對流PCR的結(jié)果，其顯示來自long人基因 組樣品的479bp GAPDH(圖45A)和363bp 0 -珠蛋白（圖45B)序列的擴增。
[0076] 圖46為使用圖5A的裝置進行熱對流PCR的結(jié)果，其顯示來自非常低拷貝的人基 因組樣品的24化P 0 -肌動蛋白序列的擴增。
[0077] 圖47顯示當將目標溫度分別設(shè)定為98°C和64°C時，圖5A裝置的第一和第二熱源 作為時間的函數(shù)的溫度變化。
[007引圖48顯示了具有12個槽的圖5A的裝置作為時間的函數(shù)的功率消耗。
[0079] 圖49A至E為使用圖11A的裝置進行熱對流PCR的結(jié)果，其顯示作為重力傾斜角 度的函數(shù)的對349bp質(zhì)粒祀標的PCR擴增加速。圖49A至E的重力傾斜角度分別為0°、 10。、20。、30。和 45°。
[0080] 圖50A至E為使用圖llA的裝置進行熱對流PCR的結(jié)果，其顯示作為重力傾斜角度 函數(shù)的對936bp質(zhì)粒祀標的PCR擴增加速。圖50A至E的重力傾斜角度分別為0°、10°、 20°、30° 和 45°。
[OOW] 圖51顯示使用圖11A的裝置進行熱對流PCR的結(jié)果，其顯示了來自Ing質(zhì)粒樣品 的多個目標序列（大小為約150bp至約化bp)的擴增。重力傾斜角度為10°。
[0082] 圖52A至E為使用圖11A的裝置進行熱對流PCR的結(jié)果，其顯示作為重力傾斜角度 的函數(shù)的對52化P人基因組祀標的PCR擴增加速。圖52A至E的重力傾斜角度分別為0°、 10。、20。、30。和 45°。
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