獼猴桃種間雜交品種金艷的分子鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物種間雜交品種的鑒定方法，尤其涉及一種獼猴桃種間雜交品種 '金艷'的分子鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 建立植物新品種鑒定和保護體系對保護育種者權益、促進植物品種創(chuàng)新、有效利 用植物種質資源和促進農林產業(yè)發(fā)展具有重要意義。分子標記因其穩(wěn)定、不受表型及環(huán)境 變異影響，已成為新品種特異性、一致性及穩(wěn)定性（即DUS測試）測試的重要手段。此外，分 子標記解決了目前育種材料遺傳基礎日益狹窄及選育品種數(shù)目增多導致的品種差異趨同 問題。利用AFLP和SSR標記等多種分子標記的方法，對油菜、玉米和水稻等多種作物成功 地進行了 DUS補充測試。在我國，玉米、水稻和大麥等作物的分子鑒定圖譜已經成為品種保 護國家標準(如，2014年頒布的《大麥品種鑒定技術規(guī)程SSR分子標記法》）。單核苷酸多態(tài) 性（SNP)標記作為第三代分子標記，目前已廣泛應用于遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳連 鎖圖譜構建和重要性狀的基因定位等相關研宄中。特別是，最近SNP標記在冬、春大麥等品 種測試中的成功運用，為獼猴桃等多倍體物種進行分子標記鑒定提供了有力示例。
[0003] 我國獼猴桃產業(yè)和科研的發(fā)展已成為獼猴桃品種分子鑒定體系開發(fā)的強勁推動 力。聯(lián)想控股現(xiàn)代農業(yè)板塊公司佳沃集團等大型企業(yè)介入農業(yè)，在產品的推介、品牌的創(chuàng)建 等方面投入大量的資金，推動了我國果品的高端化和國際化；但與此同時，一批劣質及仿冒 的品種和果品在市場流通，如何鑒定并保護新品種及其產品已成為國內企業(yè)及科研單位的 重要任務。隨著獼猴桃分子生物學技術的發(fā)展，中華獼猴桃的參考基因組草圖（616. IMb)和 39040個基因序列已經被公布并得到注釋。這為我們開發(fā)獼猴桃品種鑒定的分子標記方法 提供了科研基礎。
[0004] 本發(fā)明選擇獼猴桃種間雜交品種'金艷'為研宄對象，擬開發(fā)出一套基于測序和生 物信息學手段的鑒定獼猴桃種間雜交特征的分子鑒定方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種獼猴桃種間雜交品種'金艷'的分子鑒定方法，適用于 '金艷'雜種特性的鑒定。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的： 本方法包括下列步驟： ① '金艷'獼猴桃及其父母本即中華獼猴桃和毛花獼猴桃物種DNA的提取及全基因組 序列測定； ② '金艷'獼猴桃及其父母本物種基因組序列的過濾和質量控制； ③ '金艷'獼猴桃及其父母本物種全基因組比對到'紅陽'獼猴桃參考基因組序列； ④ '金艷'獼猴桃與母本毛花獼猴桃和父本中華獼猴桃特有SNP發(fā)掘和檢測，證實'金 艷'含有大量毛花獼猴桃和中華獼猴桃的特異SNP位點，為兩者的種間雜交后代； ⑤'金艷'種間雜交特征鑒定SNP位點的重驗證，證明此方法切實可行。
[0007] 所述的'金艷'是黃色耐貯藏的獼猴桃品種，由中國科學院武漢植物園選 育；母本為毛花獼猴桃，父本為中華獼猴桃。該品種2010年通過國家品種審定（國 S-SV-AE-019-2010)，目前是第一個商業(yè)化的獼猴桃種間雜交品種。
[0008] 所述的'紅陽'是紅色果肉的獼猴桃品種，由四川省自然資源研宄所和蒼溪縣農 業(yè)局共同選育，該品種的基因組已經被測定并正式公布在公共網站：http://bioinfo.bti. Cornell, edu/kiwi。目前，'紅陽'獼猴桃的基因組數(shù)據(jù)是其他獼猴桃物種和品種生物信息 學分析的參照數(shù)據(jù)。
[0009] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果： 本發(fā)明開發(fā)出一種適用獼猴桃種間雜交品種的分子鑒定方法，經實驗證明此套分子鑒 定方法具有重復性好、穩(wěn)定性高的特點。本發(fā)明是第一個應用于獼猴桃種間雜交品種鑒定 的方法，可推廣應用于其他類似獼猴桃種間雜交品種的分子鑒定。
【附圖說明】
[0010] 圖1是利用引物1、2、3、4擴增的'金艷'和母本毛花獼猴桃特異位點比對圖； 圖2是利用引物5擴增的'金艷'和父本中華獼猴桃特異位點比對圖。
【具體實施方式】
[0011] 下面結合附圖和實施例詳細說明： 一、方法 ①'金艷'獼猴桃及其父母本即中華獼猴桃和毛花獼猴桃物種DNA的提取及全基因組 序列測定 采用CTAB法提取'金艷'及其父本中華獼猴桃、母本毛花獼猴桃的DNA，DNA經質量檢測 合格后基于Illumina HiSeq2000測序平臺，對所有的分析樣本構建600bp、500bp和180bp 的小片段文庫，對樣本進行6. 5X以上的基因組重測序分析，獲得'金艷'及其父母本的基 因組序列； +f '金艷'獼猴桃及其父母本物種基因組序列的過濾和質量控制 從測序儀下機的數(shù)據(jù)可能包含不合格的數(shù)據(jù)，本發(fā)明按照下列標準過濾后使用：去除 N堿基含量超過5%的序列，去除低質量堿基(質量值小于5)含量大于50%的序列，去除有測 序接頭污染的序列，去除具有大量重復的序列；對過濾后的數(shù)據(jù)，使用FastQC軟件，設置為 默認參數(shù)，進行質量評價； ③測定'金艷'獼猴桃及其父母本物種基因組比對到'紅陽'獼猴桃參考基因組 首先使用Stampy軟件設置為默認參數(shù)將每個序列分別比對到參考基因組，得到.bam 格式的比對結果； 在文庫構建過程中，同一個DNA分子經過PCR擴增后可能被多次測序，得到完全相同的 序列；如果在PCR起始幾輪時出現(xiàn)錯配，這些序列會導致下游發(fā)掘SNP步驟中將這些錯配鑒 定為SNP，影響整體SNP集的正確性；因而本發(fā)明使用Picard軟件中的MarkDuplicates. jar去除比對結果中的重復序列； 初步的比對將一條條序列單獨比對上參考基因組序列，在插入缺失序列邊界的堿基通 常存在較高的比對錯誤；因此，本項目使用GATK軟件包中的RealignerTargetCreator先 鑒定出候選的插入缺失序列位置，然后再通過IndelRealigner將比對到這些位置的序列 進行多序列比對，提尚該位置的喊基比對正確率，提尚下游發(fā)掘SNP和插入缺失序列的準 確性； ++? '金艷'獼猴桃與母本毛花獼猴桃和父本中華獼猴桃特有SNP發(fā)掘、檢測并發(fā)現(xiàn)'金 艷'含有大量的父母本特異位點，證實其為種間雜交后代： 得到比對結果后，本發(fā)明使用GATK軟件包的UnifiedGenotyper對每個個體分別進行 SNP檢測；該軟件支持對多倍體進行分析；最終得到初步的檢測結果.vcf格式的文件；隨 后，使用GATK軟件包的CombineVariants將所有個體的變異檢