黃瓜6號染色體探針的制備方法及應用
【專利說明】
一、技術領域
[0001]本發(fā)明公開了利用黃瓜基因組序列制備6號染色體探針的方法，有利于促進黃瓜單染色體探針在研宄中的應用，屬于植物生物技術領域。
二、技術背景
[0002]黃瓜(Cucumis sativus L.，2n = 2x = 14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黃瓜染色體數(shù)目少，僅為14條，使得其成為近年來分子細胞遺傳學研宄的模式物種之一。同時，2009年中國和美國的研宄機構完成了對黃瓜基因組的測序，測序結果顯示黃瓜的基因組相對較小，約為370Mb，并且測序結果已經(jīng)經(jīng)過不斷地修正完善，目前的測序數(shù)據(jù)已相當準確，可以直接參考利用。
[0003]細胞遺傳相關的研宄需要對染色體進行分析，得特定染色體的探針可為染色體的結構分析、染色體異常的診斷、染色體重排、染色體比較分析等各個相關研宄提供有力的手段，染色體探針目前已在染色體方面的研宄得到廣泛利用。因此，成功制備個體染色體的探針能夠有效地推動細胞遺傳相關的研宄進程。
[0004]迄今，有關單染色體探針的制備方法主要為染色體顯微分離技術，這種方法主要是根據(jù)染色體的形態(tài)差異通過機械方法進行個體染色體或染色體臂的分離，獲得的個體染色體或染色體臂再通過隨機擴增的方法獲得足夠量的DNA，這些特定染色體的DNA集合作為染色體的探針進一步用于相關研宄。在人類和動物中，基于染色體顯微分離方法的制備的探針已經(jīng)在染色體相關研宄中廣泛應用[1]。
[0005]然而，基于染色體顯微分離制備探針的方法在植物中較難開展，其主要原因是植物染色體上分散著大量的重復序列，任何一條這種方法分離到的染色體探針在進行原位雜交分析時均會在所有染色體上產(chǎn)生大量的背景雜信號，從而無法對該特定染色體進行有效的研宄與分析。在植物中，基于大片段插入DNA克隆[例如細菌人工染色體(BAC)或酵母人工染色體(YAC)]的染色體探針代替使用顯微分離的染色體探針已得到開發(fā)利用。覆蓋整條染色體或染色體區(qū)段的BAC克隆集合已經(jīng)利用在茄屬的染色體進化研宄上[2]。然而，利用這種方法制備單染色體探針首先需要利用連續(xù)分布的分子標記篩選獲得連續(xù)排列的BAC克隆，同時需要利用焚光原位雜交(Fluorescence in situ Hybridizat1n，F(xiàn)ISH)技術篩選出不含重復序列的連續(xù)的BAC克隆。由于BAC克隆通常含有50kb-100kb或更大的基因組插入，在植物中篩選獲得不含有重復序列的BAC克隆是一項費時、繁瑣的工作。此外，BAC克隆的繁殖培養(yǎng)、質(zhì)粒DNA的制備也需要大量的人力和時間，因此在植物中很難得到廣泛的應用推廣[3]。最近在哺乳動物和果蠅細胞染色體研宄中使用復雜的核苷酸文庫進行特異性區(qū)域探針的制備，然而它們在高等植物中的應用還有待驗證[3’4]。
[0006]目前，黃瓜的基因組序列已經(jīng)比較完善，本發(fā)明提出利用黃瓜基因組序列進行單染色體探針的制備和應用。根據(jù)黃瓜的基因組序列，每隔約10kb選取一段序列，通過RepeatMasker軟件和黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫BLAST分析，篩選出不含重復序列的DNA序列，進行引物設計，通過PCR擴增與切膠回收，最終對覆蓋單條染色體的PCR產(chǎn)物進行混池，并用相應的熒光素標記后進行熒光原位雜交，制備出單條染色體探針并用于細胞學分析。這種技術方法避免了利用顯微分離法獲得單染色體探針時重復序列的干擾、和利用BAC文庫制備單染色體探針的繁雜性，僅利用簡便的PCR方法快速獲得覆蓋整條染色體的探針，可有效地用于黃瓜染色體的結構分析，染色體的進化等相關研宄。該方法也可用于任何已經(jīng)有基因組序列物種的單染色體或染色體區(qū)段的探針制備，有利于加速高等植物細胞遺傳學研宄的進展。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007](—)技術問題
[0008]本發(fā)明針對以往利用顯微分離單染色體或基于BAC文庫制備單染色體探針方法的繁瑣和不足，發(fā)明了一種通過基因組特定序列制備黃瓜單染色體探針的方法，為染色體探針制備提供了新的方法，加快了染色體探針的發(fā)展及應用。
[0009]( 二 )技術方案
[0010]本發(fā)明提供的利用黃瓜基因組序列制備單染色體探針的方法的特征在于:通過黃瓜不含重復序列的DNA測序序列，經(jīng)過快速的PCR擴增，獲得覆蓋單染色體的PCR產(chǎn)物，即可制備有效可用的探針。
[0011]上述利用黃瓜基因組序列制備染色體探針，通過以下方法獲得:
[0012](I)從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.1cug1.0rg)獲取黃瓜全基因組序列，中間隔?10kb選取一段序列，通過RepeatMasker軟件和BLAST分析進行重復序列比對，篩選出不含重復序列的序列。
[0013](2)將得到的序列用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，設定所有的引物符合退火溫度在55-65 °C，GC含量在40-60 %，擴增產(chǎn)物在2500bp-4000bp，所有弓I物的擴增可以利用同一個PCR反應程序進行，保證了操作的簡便性。
[0014](3)將設計獲得的引物進行PCR擴增，然后將產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并利用試劑盒進行回收。將回收得到的產(chǎn)物利用核酸濃度測量儀測出濃度。
[0015](4)按比例將每對引物的產(chǎn)物進行混池，然后采用缺刻平移法標探針，具體根據(jù)探針標記試劑盒說明，用Digoxigenin-1Ι-dUTP(購自Roche公司)將混池產(chǎn)物標上探針，備用。
[0016](5)探針的利用是基于熒光原位雜交在黃瓜的粗線期染色體上進行。摘取黃瓜幼小的雄花花蕾，在E: G(3: I)固定液中保存。在體視顯微鏡下解剖出處于粗線期的花藥并利用纖維素酶和果膠酶進行酶解。利用熒光原位雜交技術將標記好的探針雜交到染色體上。經(jīng)過37°C過夜雜交后進行洗片，在熒光顯微鏡下觀察探針的雜交結果。
[0017](三)有益效果
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和積極效果:
[0019](I)本發(fā)明直接利用基因組任何序列進行分析，快速獲得不含重復序列的區(qū)段，避免了利用顯微分離技術和BAC克隆技術制備染色體探針的繁瑣性以及重復序列的干擾。
[0020](2)本發(fā)明在設計引物時通過退火溫度和GC含量的設定，使所有的引物可以在同一個PCR反應程序下進行，可保證快速獲得覆蓋單染色體或任何區(qū)段的探針。
[0021 ] (3)本發(fā)明將所有的PCR產(chǎn)物混合形成一個混池，進行FISH探針的標記，對于任何一條染色體或染色體區(qū)段，直接進行一次標記即可，而BAC克隆制備單染色體需要對單個BAC克隆進行熒光原位雜交篩選可用的克隆。因此本發(fā)明基于基因組序列進行PCR制備探針的方法體現(xiàn)了經(jīng)濟、簡便、高效的特點。
四、【附圖說明】
[0022]圖1:引物PCR擴增檢測結果。圖2:黃瓜中期染色體探針混池的FISH結果。圖3:黃瓜粗線期染色體80000bp-150000bp約7Mb的探針混池的FISH結果。
五、【具體實施方式】
[0023](I)從黃瓜基因組序列中隔?10kb挑選部分序列，使用RepeatMasker軟件篩選(http://www.repeatmasker.0rg)和BLAST分析進行重復序列比對，篩選出不含重復序列的序列。
[0024](2)利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，引物長度設置