一種快速分離篩選纖維素分解真菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程及生物資源轉(zhuǎn)化利用領(lǐng)域，涉及一種纖維素分解真菌的篩選 方法。具體地講，本發(fā)明涉及一種快速分離篩選纖維素分解真菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是自然界貯量最豐富的可再生資源，據(jù)估計，通過光合作用，每年可合成纖 維素10 11?1012噸。將秸桿纖維素降解為可發(fā)酵性糖，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙醇、單細(xì)胞蛋白及氣 體燃料等，對解決全球面臨的能源危機(jī)、食品短缺及環(huán)境污染等問題具有重大意義，成為世 界關(guān)注的熱點。
[0003] 纖維素是由D葡萄糖分子以0-1，4_糖苷鍵組成的高聚物，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易降 解，目前，纖維素有效轉(zhuǎn)化的難點在于如何高效地將它降解為可發(fā)酵性糖，與酸水解法（產(chǎn) 糖率低于60 % )相比，酶催化水解的產(chǎn)糖率大于90 %，其核心之一是優(yōu)良的纖維素酶工業(yè) 生產(chǎn)菌株，酶催化水解具有反應(yīng)條件溫和、無副產(chǎn)物和污染少等優(yōu)勢。
[0004] 纖維素分解真菌廣泛存在于土壤、纖維素植物表面、亦可棲息于動物的消化道，特 別是反芻動物的瘤胃中。一般自然界在好氧條件下纖維素的分解，主要是纖維素分解真菌 在起作用；而在厭氧條件下纖維素的分解，主要是一些厭氧性的細(xì)菌起作用。通過從自然界 分離篩選出產(chǎn)纖維素分解酶的菌株，并通過生物技術(shù)提高其產(chǎn)酶效率，是解決纖維素有效 轉(zhuǎn)化利用的重要環(huán)節(jié)。
[0005] 大量研宄表明，纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶系，主要包括3種組分：內(nèi)切型 0 _1，4_葡聚糖酶，它作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解0 -1，4-糖苷鍵，將長 鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素；外切型0-1，4_葡聚糖酶， 它作用于纖維素線狀分子末端，水解0 -1，4-糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子，此酶與 濾紙酶（FPase)活性有很好的相關(guān)性；纖維二糖酶，這類酶能將纖維二糖和水溶性纖維寡 糖水解成葡萄糖分子。
[0006] 目前常用的產(chǎn)纖維素酶的菌株分離篩選方法大致為：臺盼蘭法（typanblue)、 CMC-天青法（CMC-azure)、涼乙醇沉淀法（precipitationwithchilledethanol)、十六 燒基三甲基溴化氨法（hexadecytrimethylammoneumbromide)、Unitex染色法（Unitex dyes)、剛果紅法（congored)等，其中，剛果紅法是目前比較公認(rèn)的一種分離方法。剛果紅 法的原理是：剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素（多糖物質(zhì)）形成紅色復(fù)合物，但不與單糖結(jié) 合，微生物在此培養(yǎng)基上生長，產(chǎn)生的胞外纖維素酶將纖維素降解后，紅色復(fù)合物解體，通 過NaCl溶液沖洗后，在菌落周圍形成透明圈，能形成透明圈的菌落為初篩目標(biāo)菌。將初篩 得到的單菌再行纖維素濾紙崩解實驗或纖維素酶活性測定后才能確定目標(biāo)菌。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷在于：在剛果紅初篩平板培養(yǎng)基上真菌的菌落易長滿平皿而 影響水解圈的觀察；平板培養(yǎng)基上細(xì)菌快速生長影響目標(biāo)菌的分離；剛果紅能與培養(yǎng)基中 的纖維素（多糖物質(zhì)）形成紅色復(fù)合物，也能和淀粉形成紅色復(fù)合物，因此產(chǎn)淀粉酶的菌株 也能干擾篩選結(jié)果；剛果紅初篩得到的菌株需進(jìn)行濾紙崩解的鑒別實驗，該實驗是以目測 纖維素濾紙的崩解效果，由于纖維素濾紙在液體培養(yǎng)基中會軟化、溶脹，振蕩后易破碎，因 而影響纖維素酶分解效果的判斷。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明的目的是建立一種快速、準(zhǔn)確地從各種復(fù)雜樣品（包括土壤、垃圾、污泥 等）中分離篩選纖維素分解真菌的方法。
[0009] 以解決現(xiàn)有纖維素分解真菌的分離篩選技術(shù)中存在的問題，如在剛果紅初篩平板 培養(yǎng)基上真菌的菌落易長滿平皿而影響水解圈的觀察；平板培養(yǎng)基上細(xì)菌快速生長影響目 標(biāo)真菌的分離；剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素（多糖物質(zhì)）形成紅色復(fù)合物，也能和淀粉形 成紅色復(fù)合物，因此產(chǎn)淀粉酶的菌株也能干擾篩選結(jié)果；剛果紅初篩得到的菌株需進(jìn)行濾 紙崩解的鑒別實驗，該實驗是以目測纖維素濾紙的崩解，由于纖維素濾紙在液體培養(yǎng)基中 會軟化、溶脹，振蕩后易破碎，因而影響纖維素酶分解效果的判斷。
[0010] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種快速分離篩選纖維素分解真菌 的方法，包括如下步驟：
[0011] A、選擇性富集培養(yǎng)與初篩：取樣品10g加入至200ml富集篩選培養(yǎng)基中，28°C， 150r/min搖瓶培養(yǎng)6?10天，分別吸取樣品培養(yǎng)液2ml離心，lOOOOrpm，lOmin，取500y1 用分光光度計檢測，測590nm的0D值，選0D值大于0. 3的試樣為候選含有產(chǎn)纖維素酶菌種 的試樣，取該試樣的菌液作梯度稀釋，在PDA平板上分離出單菌落；
[0012] B、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板復(fù)篩：將步驟A中分離出的單菌落分別接入多孔細(xì)胞培養(yǎng)板的 孔中培養(yǎng)，孔中培養(yǎng)基為產(chǎn)酶培養(yǎng)基300y1，28°C，靜置培養(yǎng)6天，孔中出現(xiàn)藍(lán)色者為目標(biāo) 菌，將多孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于離心機(jī)中離心，8000rpm，30min，分別吸取各孔上清200y1至另 外一個多孔細(xì)胞培養(yǎng)板用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，測590nm的0D值，選0D值大于1. 0的菌株為候 選產(chǎn)纖維素酶菌種；
[0013] C、平板培養(yǎng)復(fù)篩：將步驟B中的候選產(chǎn)纖維素酶菌種在平板復(fù)篩培養(yǎng)基上進(jìn)行劃 線培養(yǎng)，28°C，靜置培養(yǎng)6天，根據(jù)菌落顯色圈直徑與菌落直徑的比值大小確定菌種的產(chǎn)酶 能力，直徑比大于2. 2的菌種為最終纖維素酶高產(chǎn)菌株；
[0014]D、菌種保存：將目標(biāo)菌接到TOA平板培養(yǎng)基，28°C靜置培養(yǎng)7?14天，觀察菌落形 態(tài)；將目標(biāo)菌接入YH)液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，28°C，150r/min，6天，顯微鏡觀察菌體形態(tài)一 致，將YH)液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)物作甘油保存；即得纖維素分解真菌。
[0015]優(yōu)選地，所述富集篩選培養(yǎng)基的配方為：(NH4)2S0410g/l，KH2P0410g/l，AZCL-HE-cellulose10g/l，MgS04? 7H20 1.2g/l，Tween-801. 2g/l，ZnS04 ? 7H200. 01g/l， MnS04.6H20 0? 01g/l，CuS04.7H20 0? 01g/l，青霉素100U/ml，鏈霉素0?lmg/ml，pH值為 5.0。
[0016] 優(yōu)選地，所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配方為：AZCL-HE-cellulose40g/l，酵母提取物10g/ 1，MgS04?7H20 1. 2g/l，KN036g/l，（NH4)2S043g/l，KC1 1. 6g/l，KH2P0420g/l，pH值為4.5。
[0017] 優(yōu)選地，所述平板復(fù)篩培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g/l，葡萄糖40g/l， AZCL-HE-celluloselg/1，阿司匹林 0? 8g/l，瓊脂 20g/l，pH值為 5. 0〇
[0018] 本發(fā)明采用纖維素內(nèi)切酶檢測底物作為篩選指示劑和篩選培養(yǎng)基的唯一碳源，并 通過增加培養(yǎng)基的選擇壓力（包括低營養(yǎng)、低PH、抑菌劑、微量元素等），實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地 從各種復(fù)雜的樣品中分離篩選出產(chǎn)纖維酶的高產(chǎn)菌株的目標(biāo)；采用了反應(yīng)靈敏的篩選指示 劑和選擇性強(qiáng)的篩選培養(yǎng)基，聯(lián)合多孔培養(yǎng)板的應(yīng)用，使篩選工作快速、準(zhǔn)確，節(jié)約了大量 人力物力。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于能快速準(zhǔn)確地從各種復(fù)雜的樣品中分離篩選 出產(chǎn)纖維酶的高產(chǎn)菌株：
[0020] (1)采用纖維素內(nèi)切酶檢測底物（AZCL-HE-cellulose)，作為篩選指示劑和唯一 碳源的液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體搖瓶初篩，該偶聯(lián)物具水不溶性，在土壤等含復(fù)雜微生物組成 的樣品進(jìn)行液體搖瓶富集時，樣品中的目的菌產(chǎn)生的纖維素酶可將偶聯(lián)物的葡聚糖底物降 解成小分子的寡糖、纖維二糖或葡萄糖，使水不溶的偶合物成為可溶的，溶液變?yōu)樗{(lán)色，因 此可以快速接近鎖定目標(biāo)樣本，并且可以同時對多份樣品進(jìn)行初篩；
[0021] (2)復(fù)篩中采用多孔培養(yǎng)板，孔中加入以染料偶聯(lián)的葡聚糖底物 "AZCL-HE-cellulose"為篩選指示劑的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將目標(biāo)樣本中分