一種高產(chǎn)細(xì)菌素糞腸球菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)細(xì)菌素糞腸球菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們生活水平的不斷改善和提高，乳制品的消費(fèi)也日益增加，特別是一直不 太被人們接受的奶酪也逐漸成為人們?nèi)粘ｏ嬍车囊徊糠?，新鮮奶酪是指原料乳、稀奶油、乳 清或他們的混合物經(jīng)發(fā)酵劑發(fā)酵，凝乳酶凝乳，排除乳清所形成的產(chǎn)品。新鮮奶酪在制作工 藝上省去了發(fā)酵成熟這一步驟，從而使得其風(fēng)味柔和清淡，含水量大于67%，質(zhì)地介于酸奶 和奶酪之間，口感好，在國(guó)內(nèi)消費(fèi)者中的認(rèn)可度最高。但是，奶酪中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，是多數(shù)微 生物生長(zhǎng)繁殖的理想環(huán)境，尤其是致病菌和腐敗菌。奶酪生產(chǎn)中頻繁的手工操作也會(huì)造成 后加工的污染，新鮮奶酪對(duì)李斯特菌（L.Monocytogenes)的定植尤其敏感，特別容易受到 李斯特菌（L.Monocytogenes)的污染，造成微生物性食物中毒，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量， 所以確保奶酪的安全性尤為重要。
[0003] 現(xiàn)階段，人們主要通過(guò)添加化學(xué)防腐劑來(lái)控制食品中微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)食品的 保質(zhì)期。但是這些化學(xué)添加劑長(zhǎng)期的食用對(duì)人的心臟、血壓和腎臟都有很不好的影響，甚至 有的化學(xué)添加劑會(huì)有致癌變、致突變和致畸性的不良作用。在食品的生產(chǎn)加工中也常常通 過(guò)熱殺菌的方法來(lái)控制微生物的滋生，但是熱殺菌的處理方式也存在著一些弊端，它會(huì)影 響食品的品質(zhì)以及營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)受到破壞。雖然像紫外消毒、過(guò)濾除菌這些物理殺菌的方法 可以避免破壞食品的品質(zhì)，但是包裝在打開(kāi)之后就很容易受到細(xì)菌的感染。所以開(kāi)發(fā)出高 效、穩(wěn)定、安全的天然生物防腐劑已經(jīng)成為人們的迫切希望。
[0004] 乳酸菌廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，而且已經(jīng)是人們經(jīng)常消費(fèi)的一類微生物，有的乳酸 菌在生長(zhǎng)到一定階段會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌素，細(xì)菌素是一類具有抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或者蛋白 質(zhì)復(fù)合物物質(zhì)，它可以有效的抑制大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和致病菌的生長(zhǎng)，具有良好的耐酸 和耐熱能力，在體內(nèi)可以被蛋白酶水解而消化，是很好的一類生物防腐劑。將乳酸菌細(xì)菌素 應(yīng)用于新鮮奶酪加工中，奶酪的口感和味道都不會(huì)受到影響，還可以有效的抑制李斯特菌 (L.Monocytogenes)的生長(zhǎng)。
[0005] 細(xì)菌素作為一類生物防腐劑在奶酪的應(yīng)用具有巨大的空間，現(xiàn)階段，商業(yè)化的細(xì) 菌素產(chǎn)品還很有限，開(kāi)發(fā)出新型的細(xì)菌素已成為人們的期望。隨著技術(shù)的不斷提高，細(xì)菌素 將最終成為一種安全的天然生物防腐劑廣泛應(yīng)用于奶酪中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高產(chǎn)細(xì)菌素的糞腸球菌（Enterococcus faecalis)，命名為KLDS6001，分類命名為奠腸球菌（Enterococcusfaecalis)，保藏在中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院 微生物研宄所，其菌種保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 9966,保藏時(shí)間為2014年11月13日。
[0007] 本發(fā)明所提供的糞腸球菌是從傳統(tǒng)的乳制品中分離而獲得，在MRS固體培養(yǎng)基上 菌落形態(tài)為圓形、突起，色澤為乳白色、不透明，革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體形態(tài)為圓、短鏈狀 排列，經(jīng)16SrDNA鑒定為糞腸球菌。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種糞腸球菌細(xì)菌素以及生產(chǎn)該糞腸球菌細(xì)菌素的 方法。
[0009] 本發(fā)明所提供的細(xì)菌素是由本發(fā)明的糞腸球菌（Enterococcusfaecalis)發(fā)酵而 得到。具體的，包括以下步驟：
[0010] (1)糞腸球菌發(fā)酵液的制備
[0011] 將權(quán)利要求1所述的奠腸球菌（Enterococcusfaecalis)接種于MRS培養(yǎng)基中， 37°C，培養(yǎng)12-16h后得到糞腸球菌發(fā)酵液；
[0012] (2)糞腸球菌細(xì)菌素的初步純化
[0013] 將步驟（1)得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，并吸取上層清液，向該上層清液中加入 硫酸銨進(jìn)行鹽析，離心，收集沉淀，復(fù)溶于乙酸鈉緩沖溶液中，即得到細(xì)菌素的粗提物；
[0014] (3)糞腸球菌細(xì)菌素的二次純化
[0015] 將細(xì)菌素的粗提物進(jìn)一步采用葡聚糖G-25凝膠層析柱進(jìn)行分離純化，即得純化 后的細(xì)菌素。
[0016] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（1)用于培養(yǎng)奠腸球菌（Enterococcus faecalis)的MRS培養(yǎng)基成分如下：蛋白胨10. 0g、牛肉膏10. 0g、酵母粉5g、葡萄糖20. 0g、 吐溫801.lg、磷酸氫二鉀2. 0g、乙酸鈉3. 0g、檸檬酸二胺2. 0g、硫酸鎂0. 6g、硫酸錳0. 25g 以及蒸餾水l〇〇〇mL。
[0017] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（1)中的培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為14h。
[0018] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（2)中按照以下方法進(jìn)行初步純化：按步驟 (1)得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，并吸取上層清液，向該上層清液中加入飽和度為70%的 硫酸按進(jìn)行鹽析，l〇〇〇〇Xg，4°C離心30min，收集沉淀，復(fù)溶于pH6. 0的0. 02mol/L乙酸鈉緩 沖溶液中，即得到細(xì)菌素的粗提物。
[0019] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（3)中采用葡聚糖G-25凝膠層析柱進(jìn)行分 離純化所用層析條件為：用50% (w/w)的氯化鈉和50% (w/w)乙酸鈉的緩沖液進(jìn)行洗脫， 流速為lmL/min，樣品上樣量為400yL，收集保留時(shí)間在14-16min內(nèi)的蛋白峰產(chǎn)物即為純 化后的細(xì)菌素。
[0020] 研宄表明，將所述方法得到的細(xì)菌素以及含有細(xì)菌素的糞腸球菌發(fā)酵液以2 %添 加到含有1%李斯特菌的新鮮奶酪中，在儲(chǔ)存的5天內(nèi)，可以有效抑制李斯特菌的生長(zhǎng)，且 新鮮奶酪的水分以及蛋白質(zhì)含量無(wú)明顯變化。
[0021] 此外，按照本發(fā)明所述方法制備得到的細(xì)菌素以及含有細(xì)菌素的糞腸球菌發(fā)酵 液，有很好的耐熱能力，121°C處理30min仍保持抑菌活性，對(duì)酸穩(wěn)定，在pH2. 5-7. 5的范圍 內(nèi)保持穩(wěn)定的抑菌活力。胃蛋白酶、蛋白酶K、a-淀粉酶均可使細(xì)菌素部分失活。
[0022] 因此，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述的糞腸球菌細(xì)菌素或者含該細(xì)菌素的糞腸 球菌發(fā)酵液在抑制李斯特菌（L.Monocytogenes)生長(zhǎng)中的應(yīng)用。以及
[0023] 所述的糞腸球菌細(xì)菌素或者含有該細(xì)菌素的糞腸球菌發(fā)酵液在制備新鮮奶酪發(fā) 酵劑中的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是細(xì)菌素對(duì)新鮮奶酪中李斯特菌的抑制情況；
[0025] 圖2為新鮮奶酪的制作過(guò)程。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0027] 實(shí)施例1糞腸球菌的分離及鑒定
[0028] 本發(fā)明所提供的糞腸球菌是從傳統(tǒng)的乳制品中分離而獲得，在MRS固體培養(yǎng)基上 菌落形態(tài)為圓形、突起，色澤為乳白色、不透明，革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體形態(tài)為圓、短鏈狀 排列。經(jīng) 16SrDNA鑒定為奠腸球菌（Enterococcusfaecalis)。
[0029]所述的奠腸球菌（Enterococcusfaecalis)，命名為KLDS6001，分類命名為奠腸 球菌（Enterococcusfaecalis)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研宄所，其菌種保藏編號(hào)為：CGMCC No. 9966,保藏時(shí)間為2014年11月13日。
[0030] 實(shí)施例2糞腸球菌細(xì)菌素的制備
[0031] (1)糞腸球菌發(fā)酵液的制備
[0032] 將糞腸球