提高植物抗蟲性的融合蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及新型重組的抗蟲融合蛋白及其 制法和用途。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)新型重組的抗蟲融合蛋白的基因工程技術(shù)平臺及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蟲害是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計，全球每年因 病蟲草害而損失的糧食約占總產(chǎn)量的三分之一，其中以蟲害損失最多，達14%。我國農(nóng)作物 主要的蟲害有1500多種，危害特別嚴重的有棉鈴蟲、玉米螟、小菜蛾、飛虱、蚜蟲、蝗蟲等幾 十種。它們頻繁成災(zāi)，造成大量的經(jīng)濟損失，因此迫切需要采用有效的害蟲防治措施來降低 害蟲損失。從上世紀40年代開始，化學(xué)農(nóng)藥和有機殺蟲劑在害蟲防治實踐中表現(xiàn)出高效的 殺蟲效果，為害蟲防治帶來了革命性改變。但隨著其長期大量使用，土壤退化、農(nóng)藥殘留、水 源和環(huán)境污染、生物鏈中斷、生態(tài)失衡等一系列負面問題日益凸顯。因此，開發(fā)環(huán)境友好、高 效、低毒的防治方法和植物抗蟲技術(shù)是攸關(guān)國家經(jīng)濟發(fā)展、社會進步和食品安全所亟需解 決的關(guān)鍵問題。轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是現(xiàn)代害蟲防治的主要發(fā)展方向之一。
[0003] 常用的抗蟲基因源包括：蘇云金芽孢桿菌、蛋白酶抑制劑、植物凝集素、淀粉酶抑 制劑、昆蟲神經(jīng)激素等。然而，但除轉(zhuǎn)Bt植物外，應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的成功個例極少。
[0004] 咀嚼式口器害蟲取食植物的葉和莖。它們攝食后，轉(zhuǎn)基因植物表達的殺蟲蛋白如 Bt毒素在中腸內(nèi)快速釋放出來，在腸腔內(nèi)結(jié)合中腸基膜（包括圍食膜和腸壁腸膜）的靶標 蛋白殺蟲。因為刺吸式口器害蟲對植物的危害是通過其口針刺入植物組織吸取植物汁液來 實現(xiàn)，對利用轉(zhuǎn)基因植物手段進行生物防治的要求更高，難度更大。
[0005] 干擾昆蟲中腸正常生理功能是有效的抗蟲途徑。中腸是昆蟲消化和吸收的主要器 官，中腸內(nèi)有大量的蛋白酶可以消化降解包括殺蟲蛋白在內(nèi)的所有外源蛋白。因此，干擾中 腸消化液中的蛋白酶活性可以起到很好的抗蟲作用。植物和昆蟲存在相互作用，植物可以 主動或被動分泌一些蛋白來直接作用于昆蟲中腸組織并干擾其生理功能，進而影響昆蟲的 取食，比如很多植物為了有效地阻止昆蟲的攝食會分泌一些蛋白酶抑制劑。
[0006] 中腸也是昆蟲的主要免疫器官之一。昆蟲中腸的圍食膜是一層厚厚的含有大量幾 丁質(zhì)的結(jié)締組織。中腸圍食膜可以防止絕大部分具有潛在破壞作用的外源微生物和外源大 分子進入中腸細胞和血液循環(huán)，是昆蟲免疫的第一道天然屏障。破壞中腸的組織結(jié)構(gòu)是一 個有效的殺蟲途徑。影響中腸細胞的離子通道和中腸的蠕動也可用于抗蟲。
[0007] 然而，迄今為止，尚沒有開發(fā)出令人滿意的有效的抗蟲蛋白。因此，開發(fā)具有具有 顯著抗蟲活性的蛋白，以便提高植物的抗蟲性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一個基因工程技術(shù)平臺，利用該平臺可生產(chǎn)重組的抗蟲融 合蛋白類藥物如AalT-GNA，并闡明其用途。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述 結(jié)構(gòu)：
[0010]A-B-C (Ia)，或
[0011] C-B-A (Ib)
[0012] 其中，
[0013] A為神經(jīng)肽AaIT元件；
[0014] B為任選的連接肽；
[0015] C為植物凝集素元件；
[0016] 表示連接上述元件的肽鍵。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物凝集素為單子葉或雙子葉植物的凝集素；
[0018]較佳地，所述的植物凝集素選自下組：雪花蓮凝集素（GNA)、豌豆凝集素（P-Lec)、 麥胚凝集素（WGA)、半夏凝集素（PTA)、莧菜凝集素（ACA)或其組合。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物凝集素為甘露糖結(jié)合凝集素。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物凝集素為單子葉甘露糖結(jié)合凝集素。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物凝集素為雪花蓮凝集素（GNA)。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)肽AaIT元件來自蝎屬（Scorpionoidea)，更佳地來 自北非蝎（Androctonus australis)。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)肽AaIT元件選自下組：
[0024] (al) SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列；
[0025] (bl)將SEQ ID NO: 1氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加 而形成的，且具有抑制昆蟲中腸蠕動的功能的由（al)衍生的多肽；
[0026] (Cl)SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列的活性片段，所述活性片段具有抑制昆蟲中 腸蠕動的功能。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物凝集素元件選自下組：
[0028] (a2) SEQ ID NO. : 2所示的氨基酸序列；
[0029] (b2)將SEQ ID NO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加 而形成的，且具有凝集素的功能的由（a2)衍生的多肽；
[0030] (C2)SEQ ID NO. :2所示的氨基酸序列的活性片段，所述活性片段具有凝集素的功 能。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的連接肽包括：柔性肽接頭（長度通常為4-10個氨基酸）、 或由酶切位點所引入的連接肽。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白還具有信號肽。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的信號肽是GNA的信號肽。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白的序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白具有殺蟲活性。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白還具有以下一種或多種特性：
[0037] a)可干擾昆蟲的中腸消化液中的蛋白酶活性；
[0038] b)可影響中腸細胞的離子通道；
[0039] c)可抑制昆蟲中腸的蠕動；
[0040] d)可破壞昆蟲中腸結(jié)構(gòu)。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的殺蟲（抗蟲）活性包括殺滅害蟲、抑制生長、昆蟲拒食等。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的害蟲包括昆蟲，尤其是具刺吸式口器的昆蟲、具咀嚼式口 器的昆蟲。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，上述的肽接頭的長度為1-30個氨基酸，較佳地2-15個氨基酸。
[0044] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明 第一方面所述的融合蛋白。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO. :3所示。
[0046] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。
[0047] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發(fā)明第三方面所述的載體 或基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞包括植物細胞。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括雙子葉植物和單子葉植物，較佳地包括各種農(nóng) 作物、林木、蔬菜、花卉。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物細胞包括擬南芥、煙草、水稻、玉米、大豆、白菜、木薯 等。
[0051] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種產(chǎn)生蛋白的方法，它包括步驟：
[0052] 在適合表達的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細胞，從而表達出本發(fā)明 第一方面所述的融合蛋白。
[0053] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟：
[0054] 用第三方面所述的載體轉(zhuǎn)化植物細胞，從而獲得含有第三方面所述的載體或基因 組中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸的、經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞；
[0055] 將所述轉(zhuǎn)化的植物細胞再生成植株。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：對所述再生的植株，檢測本發(fā)明第一方面 所述的融合蛋白的表達情況。
[0057] 在本發(fā)明的第七方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白和/或本發(fā)明 第二方面所述的多核苷酸的用途，它們被（a)用于制備殺蟲制劑，（b)用于制備提高植物抗 蟲性的制劑；和/或（C)用于提高植物抗蟲性。
[0058] 在本發(fā)明的第八方面，提供了一種農(nóng)用組合物，所述的農(nóng)用組合物含有本發(fā)明第 一方面所述的融合蛋白以及農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。
[0059] 在本發(fā)明的第九方面，提供了一種殺滅環(huán)境中害蟲的方法，包括步驟：在需要殺滅 害蟲的環(huán)境（如農(nóng)田、土壤等）中，施用本發(fā)明第八方面所述的農(nóng)用組合物。
[0060] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具體描 述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不 再一一累述。
【附圖說明】
[0061] 圖1為轉(zhuǎn)基因載體示意圖。三種載體均以植物表達載體PCAMBIA1301為轉(zhuǎn)基因基 本骨架，選用組成性表達的玉米泛素蛋白做為啟動子，篩選標記選用潮霉素。
[0062] 圖2顯示了轉(zhuǎn)基因煙草DNA水平鑒定。
[0063] 圖3顯示了轉(zhuǎn)基因煙草RNA水平的鑒定。
[0064] 圖4顯示了轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA水平鑒定。
[0065] 圖5顯示了轉(zhuǎn)基因擬南芥RNA水平的鑒定。
[0066] 圖6顯示了轉(zhuǎn)基因水稻DNA水平鑒定。
[0067] 圖7顯示了轉(zhuǎn)基因水稻RNA水平的鑒定。
[0068] 圖8顯示了轉(zhuǎn)AG的煙草對棉鈴蟲的抗性顯著提高。其中，將30頭同樣大小的3 齡棉鈴蟲釋放入實驗植株7