一種海綿動(dòng)物水溶性肽類的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種肽類制備方法，尤其是涉及一種海綿動(dòng)物水溶性肽類的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人們已經(jīng)從海洋生物中分離出20, 000余種天然產(chǎn)物，包括肽類、蛋白質(zhì)類、多糖 類、生物堿類、萜類、大環(huán)聚酯類等，其中數(shù)量龐大的一類化合物是肽類，相較于大蛋白，肽 類的分子量小、無(wú)免疫原性、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、副作用小、生物活性高。又由于海洋生物生存的特定 環(huán)境，海洋肽類的結(jié)構(gòu)與陸生動(dòng)植物肽有很大不同，海洋肽類的開發(fā)日益成為海洋藥物研 宄的熱點(diǎn)。
[0003] 海綿屬于多孔動(dòng)物門，是動(dòng)物中最低等的多細(xì)胞無(wú)脊椎動(dòng)物，也是最具開發(fā)潛 力的藥源海洋生物。在目前發(fā)現(xiàn)的海洋天然產(chǎn)物中，有7, 000多種來(lái)自海綿，并以每年 200余種新化合物的發(fā)現(xiàn)速度遞增。其中的新型肽類不僅占了較高比例，某些還極具藥 用開發(fā)潛力。比如海綿來(lái)源的一種三肽化合物Hemiasterlin是微管蛋白的解聚物，能 誘導(dǎo)有絲分裂阻滯和細(xì)胞凋亡，具有良好的開發(fā)為抗癌藥物的潛力（Bai，R.，Durso,N. A.,Sackett,D.L.andHamel,E. (1999)Interactionsofthesponge-derived antimitotictripeptidehemiasterlinwithtubulin:comparisonwithdolastatin IOandcryptophycinI.Biochemistry，38, 14302-1431)。從蒂殼海綿屬Theonella sp.中分離得到雙環(huán)肽類TheonellamideA-F，它們有強(qiáng)烈的抗真菌活性（Wada，S.，Mat sunaga,S. ,Fusetani,N.andWatabe,S. (1999)TheonellamideF，aBicyclicPeptide MarineToxin,InducesFormationofVacuolesin3YlRatEmbryonicFibroblast. MarBiotechnol(NY)，1，337-341 ;3.Wada，S.，Matsunaga，S.，F(xiàn)usetani，N.andWatabe，S. (2000)InteractionofCytotoxicBicyclicPeptides，TheonellamidesAand F,withGlutamateDehydrogenaseandl7beta-HydroxysteroidDehydrogenaseIV.Mar Biotechnol(NY), 2, 285-292)。這些例子表明海綿肽類的開發(fā)前景良好。但是已發(fā)現(xiàn)的海 綿肽類主要是通過(guò)有機(jī)萃取獲得的，肽類通常與其他類別的化合物混雜在一起，目前還沒(méi) 有一個(gè)系統(tǒng)富集和分離海綿肽類的方法，肽的種類、分離效率和規(guī)模受到極大限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供可增加肽的種類、提高處理規(guī)模和分離效率，以便利海綿活 性肽類藥物開發(fā)的一種海綿動(dòng)物水溶性肽類的制備方法。
[0005] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0006] 1)將海綿動(dòng)物破碎，用提取緩沖液浸泡，超聲，離心后獲得可溶解蛋白/肽類水溶 液，過(guò)濾后進(jìn)行吸附/解吸附，獲得脫鹽后的肽類第一級(jí)粗提物；
[0007] 2)將肽類第一級(jí)粗提物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行第二級(jí)純化得10?30個(gè)第二級(jí)組 分，或再經(jīng)冷凍干燥以粉末狀態(tài)避光低溫長(zhǎng)期保存；
[0008] 3)將第二級(jí)組分中主成分小于95%的二級(jí)組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行第三級(jí)純 化得海綿動(dòng)物水溶性肽類，或再經(jīng)冷凍干燥以粉末狀態(tài)避光低溫長(zhǎng)期保存。
[0009] 在步驟1)中，所述破碎可采用冷凍破碎或凍干后破碎；所述冷凍破碎可在液氮溫 度下用粉碎機(jī)破碎海綿動(dòng)物組織塊；所述凍干后破碎可將海綿凍干后用粉碎機(jī)破碎；
[0010] 所述提取緩沖液的配方可為：水，10%乙醇，20禮1^8-11(：1?117.5,51111￡0丁八， 0.5 %TritonX-100或NP-40,臨用時(shí)加lmM0-巰基乙醇、20yM苯硫脲、ImMPMSF和 10yg/mL抑肽酶，每隔Ih加一次PMSF;
[0011] 所述浸泡可于4°c層析柜中以2?4倍海綿動(dòng)物質(zhì)量的提取緩沖液浸泡，浸泡時(shí) 間為1?2h;所述離心可于8000Xg離心30min;所述過(guò)濾可采用切向流過(guò)濾，所述切向流 過(guò)濾可采用PALLCentramate超濾系統(tǒng)，先用MWC0300K膜包濾去大分子蛋白，濾過(guò)液再用 MWC05K或MWCOlK膜包濾過(guò)小分子蛋白/肽類，需要注意的是膜包標(biāo)稱的濾過(guò)或截留孔徑大 小要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，標(biāo)稱IOK的膜包在實(shí)際中會(huì)濾過(guò)部分10?20K的蛋白；
[0012] 所述吸附/解吸附流程可采用大孔吸附樹脂吸附，將處理好的大孔吸附樹脂與切 向流濾過(guò)液混合，4°C下，通過(guò)搖床、磁力攪拌、機(jī)械攪拌等方式連續(xù)攪拌10?14h，之后用 去離子水漂洗大孔吸附樹脂至少5次，再將大孔吸附樹脂裝入層析柱用層析系統(tǒng)在280nm 或215nm波長(zhǎng)檢測(cè)肽類洗脫過(guò)程，洗脫中逐步提高乙醇濃度到75%，最后用50mMNaOH洗 脫，最大量的組分在60%?75%乙醇區(qū)間洗脫，收集10%?50乙醇洗脫組分和50mMNaOH 洗脫組分；所述大孔吸附樹脂與切向流濾過(guò)液的體積比可為1 : (3?20);所述大孔吸附 樹脂可采用型號(hào)為DA201-C、NKA-9、AB-8或DlOl等大孔吸附樹脂中的一種，優(yōu)選型號(hào)為 DA201-C大孔吸附樹脂。
[0013] 在步驟2)中，所述第二級(jí)純化的具體方法是采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙 腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱WelchUltimataXB-C18,內(nèi)徑30mm，高度250mm， 填料粒徑l〇ym，孔徑300A，或同類型產(chǎn)品；所用的流動(dòng)相含〇. 1%三氟乙酸；上樣樣品用 起始乙腈濃度含0. 1 %三氟乙酸的水溶液溶解；第二級(jí)純化的HPLC每次上樣3. 5mL，梯度程 序?yàn)椋? ?40min，3%- 70% 乙腈；40 ?43min，70%- 100% 乙腈；43 ?53min，100% 乙腈， 流速27mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm或215nm。
[0014] 在步驟3)中，所述第三級(jí)純化的具體方法可采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙 腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱WelchUltimataXB-C18,內(nèi)徑30mm，高度250mm， 填料粒徑l〇ym，孔徑300A,或同類型產(chǎn)品；所用的流動(dòng)相含〇.I%三氟乙酸；上樣樣品用 起始乙腈濃度含0. 1 %三氟乙酸的水溶液溶解；第三級(jí)純化的HPLC每次上樣0. 5?I.OmL， 以二級(jí)組分收集點(diǎn)的乙腈濃度減3%的乙腈-水溶液等度洗脫40min;40 - 45min，乙腈濃 度升到 100% ;45 - 55min，100% 乙腈，流速 13. 5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 280nm或 215nm。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0016] 1.高效而廉價(jià)。水溶性肽類提取的難點(diǎn)在于脫鹽，許多寡肽的分子量小于1000， 很難與水溶液中的鹽類分開。脫鹽可采取凝膠過(guò)濾、固相萃取或納濾方法。凝膠過(guò)濾填料 貴，上樣量少，每次耗時(shí)長(zhǎng)。以價(jià)格1萬(wàn)元的凝膠過(guò)濾柱處理Ikg濕重海綿溶出的水溶性肽 合計(jì)用時(shí)15天以上，并隨處理量的增加而等比例增加，這么長(zhǎng)的處理時(shí)間在效率上、在肽 類的活性保留上是非常不利的。另一類脫鹽方法是C18或C8固相萃取，但這類固相萃取填 料與水溶液不親和，水系溶液不易通過(guò)，升以上的操作很難開展。實(shí)驗(yàn)室通用的離心納濾也 可小規(guī)模地脫鹽，但L級(jí)以上的脫鹽在成本上不可承受。本發(fā)明以大孔吸附樹脂方法脫鹽， 在規(guī)模、成本和時(shí)間上有很大優(yōu)勢(shì)。大孔吸附樹脂對(duì)肽類的吸附量高，操作便捷，而價(jià)格僅 為凝膠過(guò)濾填料、C18固相萃取填料的1/150?1/100?；ㄙM(fèi)時(shí)間上，處理3?30L水提液 耗時(shí)均不超過(guò)2天；在耗材、能源消耗上，比凝膠過(guò)濾方法節(jié)約10倍以上；在得率上，本發(fā) 明的方法略低于凝膠過(guò)濾，約為后者的70%?85%，但由于高效，可以加大初始原材料的 量來(lái)彌補(bǔ)。
[0017] 2.處理通量高，易于放大。海綿肽類的藥物開發(fā)涉及活性篩選、結(jié)構(gòu)測(cè)定和各種體 外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，至少需提純到IOOmg以上的純肽才能開展這些實(shí)驗(yàn)。這就要求分離提純的通 量要高，容易放大。本發(fā)明很容易就能放大規(guī)模，一次能獲得50g級(jí)別的粗提物，足以支撐 幾十種肽類的各類實(shí)驗(yàn)。
[0018] 3.本發(fā)明富集的肽的種類極為豐富。對(duì)苔海綿第一級(jí)肽類粗提物的液相色譜串聯(lián) 質(zhì)譜分析，在分子量1060?2850區(qū)間鑒定出了 262種能在轉(zhuǎn)錄組找到序列的肽（見實(shí)施 例2)。
[0019] 4.本發(fā)明系統(tǒng)地富集了肽類，可以與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)方法聯(lián)用，快速 對(duì)各分離組分中的肽類定性定量，極大便利活性組分的成分分析。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為切向流過(guò)濾對(duì)海綿水溶性蛋白的分組。M.分子量標(biāo)記；1.總水溶性蛋白； 2. 30K膜包濾過(guò)、IOK膜包截留；3.IOK膜包濾過(guò)、IK膜包截留。
[0021] 圖2為實(shí)施例1大孔吸附樹脂的洗脫曲線。
[0022] 圖3為實(shí)施例1的第二級(jí)分離洗脫曲線。
[0023] 圖4為實(shí)施例2進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的總離子流色譜圖。<