定量檢測ecm1基因表達(dá)的引物和探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種定量檢測ECM1基因表達(dá)的引物和探針 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] ECM1編碼一種可溶性蛋白質(zhì)參與軟骨內(nèi)骨形成、血管生成和腫瘤生物學(xué)。與很多 細(xì)胞外蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，參與皮膚完整性和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。該基因突變與類脂性 蛋白沉積癥相關(guān)，也可見少量與喉癌，黑色素瘤，乳頭狀甲狀腺癌，肝細(xì)胞癌相關(guān)的報(bào)道，未 見與白血病相關(guān)研宄。
[0003] ECM1在良性喉部病變、喉部癌前病變、惡性喉部病變的表達(dá)逐漸增高。同時(shí)，轉(zhuǎn)移 性喉癌的ECM1表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移的喉癌。ECM1參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。
[0004] ECM1在浸潤性導(dǎo)管乳房癌，食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌癥，直腸癌、肺癌和甲狀腺癌高 表達(dá)。ECM1在癌癥的陽性率為75%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在上皮增生（11. 7% )或正常組織（7. 1% ) 的表達(dá)。這些結(jié)果提示盡管ECM1可能并非一個(gè)腫瘤特異的蛋白，但是其表達(dá)水平在惡性上 皮腫瘤顯著上升。ECM1在一些惡性疾病中有預(yù)后意義。Wangetal研宄顯示伴有淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移的乳腺癌和肺癌比沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ECM1陽性率更高。一項(xiàng)單中心研宄顯示侵襲性 乳腺癌的患者ECM1過表達(dá)是獨(dú)立的長期預(yù)后指標(biāo)。ECM1在喉癌、肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌過 表達(dá)，且與微血管、生長、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。此外，一些研宄顯示ECM1的表達(dá)可能成為 預(yù)測高危甲狀腺癌癥的一個(gè)積分模型的一部分。小鼠乳腺上皮細(xì)胞的cDNA微陣列分析顯 不ECM1是活化的Wnt/0-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的革E1基因（KennyPA,EnverT,Ashworth A(2005)Receptorandsecretedtargetsofffnt-l/beta-cateninsignallinginmouse mammaryepithelialcells.BMCCancer5:3.)。另外人乳腺上皮細(xì)胞的研宄顯示過表達(dá) TFAP2A或TFAP2C誘導(dǎo)ECM1的表達(dá)，提示ECM1的表達(dá)可能受TFAP2的調(diào)節(jié)。有報(bào)道稱ECM1 參與促進(jìn)血管生成，ECM1的表達(dá)似乎與快速細(xì)胞分裂有關(guān)。在關(guān)于ECM1在黑素瘤的表達(dá) 及ECM1調(diào)節(jié)的機(jī)制仍然有限。研宄發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性黑色素細(xì)胞相比，ECM1在多個(gè)黑色瘤細(xì) 胞系的表達(dá)增高，而且在多個(gè)細(xì)胞系中ECM1的表達(dá)伴隨著TFAP2C(轉(zhuǎn)錄因子AP2-gamma，惡 性黑色素瘤的預(yù)后因素）水平的表達(dá)。用siRNA敲除A375細(xì)胞中的TFAP2C后，ECM1表達(dá) 下降。用腺病毒轉(zhuǎn)染W(wǎng)M793細(xì)胞系上調(diào)TFAP2C后，ECM1表達(dá)上調(diào)。
[0005] 過表達(dá)ECM1參與膽管細(xì)胞型肝癌細(xì)胞的迀移和侵襲：ECM1在膽管細(xì)胞型肝癌的 表達(dá)顯著高于鄰近的非癌變、膽管炎和正常膽管組織。其過表達(dá)與分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù) 后差有關(guān)以及與CA199、MMP-9和雌激素受體的上升有關(guān)。敲除ECM1抑制了膽管細(xì)胞型肝 癌細(xì)胞的迀移和侵襲。
[0006] 應(yīng)用免疫組化研宄ECM1在一些腫瘤的表達(dá)：侵襲性乳腺導(dǎo)管癌（83% )，食管鱗癌 (73% )，胃癌（88% )，結(jié)腸直腸癌（78% )。ECM1的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。形成轉(zhuǎn)移性 腫瘤的原發(fā)乳腺癌的ECM1陽性率為76%而沒有轉(zhuǎn)移的僅有33%陽性。
[0007] ECM1與肝細(xì)胞性肝癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)：在4個(gè)肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞系中，ECM1在HCCLM3 細(xì)胞（轉(zhuǎn)移性最高）的表達(dá)顯著高于其他肝癌細(xì)胞系，而且ECM1在正常肝細(xì)胞系不表達(dá)。 與癌旁組織和正常肝組織相比，ECM1在肝細(xì)胞性肝癌的表達(dá)顯著增高。免疫組化顯示，ECM1 的在57例患者陽性表達(dá)（74.0% )，顯著高于相應(yīng)癌旁組織，而且與腫瘤大小、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù) 目、?M分期和血管侵襲性相關(guān)。尤其注意的是，ECM1的表達(dá)是肝癌OS和DFS獨(dú)立預(yù)后因 素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種試劑盒。
[0009] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括DNA分子甲，所述DNA分子甲由引物對甲和探針甲組 成；
[0010] 所述引物對甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分 子組成；
[0011] 所述探針甲為序列表中序列3所示的單鏈DNA分子。
[0012] 上述試劑盒的功能為如下1) _3)中任一種：
[0013] 1)輔助診斷腫瘤患者；
[0014] 2)輔助鑒定腫瘤細(xì)胞系；
[0015] 3)定量檢測ECM1基因的表達(dá)量。
[0016] 上述試劑盒中，所述試劑盒還包括含有ECM1基因或其片段的陽性對照質(zhì)粒。
[0017] 上述試劑盒中，所述陽性對照質(zhì)粒為含有序列表中序列7所示的ECM1基因片段的 重組質(zhì)粒。
[0018] 上述試劑盒中，所述陽性對照質(zhì)粒為將PMD18-T載體與序列表中序列7所示的 ECM1基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。
[0019] 上述試劑盒中，所述DNA分子甲中，所述序列表中序列1所示的單鏈DNA分子、所 述序列表中序列2所示的單鏈DNA分子、所述探針甲的摩爾比為40:40:25。
[0020] 所述血液腫瘤患者具體為急性淋巴白血病患者，為急性淋巴白血病初診患者或難 治復(fù)發(fā)患者；
[0021] 所述淋巴腫瘤為淋巴癌，具體為套細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤或組織細(xì)胞性淋巴 瘤；套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系為Maver、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系為頂9、組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞系 為U937;
[0022] 所述血液腫瘤為急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病急變或急性早幼粒細(xì)胞 白血病；急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系為SUP-B15、Molt4、Jurkat、6T-CEM;慢性粒細(xì)胞白血 病急變?yōu)镸EG-1a或K562;急性早幼粒細(xì)胞白血病為HL60。
[0023] 上述試劑盒還包括DNA分子乙，所述DNA分子乙由引物對乙和探針乙組成，
[0024] 所述引物對乙由序列表中序列4所示的單鏈DNA分子和序列5所示的單鏈DNA分 子組成；
[0025] 所述探針乙為序列表中序列6所示的單鏈DNA分子。
[0026] 上述試劑盒還包括內(nèi)參對照質(zhì)粒，所述內(nèi)參對照質(zhì)粒為含有序列表中序列8所示 的ABL1基因片段的重組質(zhì)粒。
[0027] 上述試劑盒中，所述陽性對照質(zhì)粒為將PMD18-T載體與序列表中序列8所示的 ABL1基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。
[0028] 上述試劑盒中，所述DNA分子乙中，所述序列表中序列4所示的單鏈DNA分子、所 述序列表中序列5所示的單鏈DNA分子、所述探針乙的摩爾比為40:40:25。
[0029] 上述DNA分子甲在制備試劑盒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0030] 上述DNA分子甲和上述陽性對照質(zhì)粒在制備試劑盒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的 范圍。
[0031] 上述試劑盒的功能為如下1) _3)中任一種：
[0032] 1)輔助診斷腫瘤患者；
[0033] 2)輔助鑒定腫瘤細(xì)胞系；
[0034] 3)定量檢測ECM1基因的表達(dá)量；
[0035] 所述血液腫瘤患者具體為急性淋巴白血病患者，為急性淋巴白血病初診患者或難 治復(fù)發(fā)患者；
[0036] 所述淋巴腫瘤為淋巴癌，具體為套細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、伯基特淋巴瘤或組 織細(xì)胞性淋巴瘤；套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系為Maver、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系為頂9/BCL2、伯基特 淋巴瘤細(xì)胞系為Raji、組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞系為U937 ;
[0037] 所述血液腫瘤為急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病急變或急性早幼粒細(xì)胞 白血病；急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系為SUP-B15、Molt4、Jurkat、6T-CEM;慢性粒細(xì)胞白血 病急變?yōu)镸EG-1a或K562 ;急性早幼粒細(xì)胞白血病為HL60或NB4。
[0038] 本發(fā)明提供的引物對和探針，可以用于定量檢測ECM1基因表達(dá)水平，從而用于腫 瘤細(xì)胞系的輔助鑒定或腫瘤患者的輔助診斷，將在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。
【附圖說明】
[0039] 圖1為陽性對照質(zhì)粒的RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0040] 圖2為引物和探針檢測細(xì)胞系的結(jié)果
[0041] 圖3為引物和探針檢測白急性淋巴血病患者的結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0043] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044] 實(shí)施例1、檢測ECM1表達(dá)的特異引物和探針設(shè)計(jì)
[0045] 針對ECM1基因（NCBI基因庫序列號：NM_022664. 2,提交時(shí)間是2013. 4. 17,序列 7)的設(shè)計(jì)特異性引物對甲（由上游引物ECM1-FP和下游引物ECM1-RP組成，擴(kuò)增產(chǎn)物為 83bp)和探針甲（探針ECMl-probe):
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種試劑盒，包括DNA分子甲，所述DNA分子甲由引物對甲和探針甲組成； 所述引物對甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組 成； 所述探針甲為序列表中序列3所示的單鏈DNA分子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒的功能為如下1) _3)中任 一種： 1) 輔助診斷腫瘤患者； 2) 輔助鑒定腫瘤細(xì)胞系； 3) 定量檢測ECM1基因的表達(dá)量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括含有ECM1基因 或其片段的陽性對照質(zhì)粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述陽性對照質(zhì)粒為含有序列表中序 列7所示的ECM1基因片段的重組質(zhì)粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述陽性對照質(zhì)粒為將pMD18-T載體 與序列表中序列7所示的ECM1基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的試劑盒，其特征在于：所述DNA分子甲中，所述序列表中序 列1所示的單鏈DNA分子、所述序列表中序列2所示的單鏈DNA分子、所述探針甲的摩爾比 為 40:40:25。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述腫瘤為淋巴腫瘤或血液 腫瘤。
8. 權(quán)利要求1-7中任一所述DNA分子甲在制備試劑盒中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1-7中任一所述DNA分子甲和權(quán)利要求3-7中任一所述陽性對照質(zhì)粒在制 備試劑盒中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述試劑盒的功能為如下1)-3)中 任一種： 1) 輔助診斷腫瘤患者； 2) 輔助鑒定腫瘤細(xì)胞系； 3) 定量檢測ECM1基因的表達(dá)量； 所述腫瘤為淋巴腫瘤或血液腫瘤。
【專利摘要】本發(fā)明公開了定量檢測ECM1基因表達(dá)的引物和探針及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種試劑盒，包括DNA分子甲，所述DNA分子甲由引物對甲和探針甲組成；所述引物對甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述探針甲為序列表中序列3所示的單鏈DNA分子。本發(fā)明提供的引物對和探針，可以用于定量檢測ECM1基因表達(dá)水平，從而用于腫瘤細(xì)胞系的輔助鑒定或腫瘤患者的輔助診斷，將在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104531858
【申請?zhí)枴緾N201410795284
【發(fā)明人】阮國瑞, 劉開彥, 黃曉軍, 王衛(wèi)敏, 周嬌, 姚秋妹, 李金蘭, 冷馨, 李玲娣
【申請人】北京大學(xué)人民醫(yī)院
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月18日