專利名稱:微生物菌劑的清潔高效生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物菌劑的清潔高效生產(chǎn)方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微生物菌劑是指以一種或多種微生物菌株經(jīng)過一系列發(fā)酵及后加工工藝而得到的微生物活菌及其代謝產(chǎn)物。其劑型有液體、粉狀或顆粒。主要發(fā)酵方法為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。主要用途有用作藥品、飼料添加劑、農(nóng)作物殺蟲劑，用于農(nóng)作物防病增產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境保護(hù)和污染防治。其中環(huán)保微生物菌劑廣泛用于養(yǎng)殖水體改良、生活垃圾處理、畜禽糞便無害化處理、工業(yè)、生活污水脫氮除磷和COD的降解等。
眾所周知，由于固體發(fā)酵很難實(shí)行自動化，所以勞動強(qiáng)度大，生產(chǎn)效率低，產(chǎn)物很難避免感染雜菌。液體發(fā)酵是指營養(yǎng)基質(zhì)懸浮或溶解在水中的發(fā)酵方式，易于自動化和大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)流程可以標(biāo)準(zhǔn)化控制，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以生產(chǎn)不含雜菌的醫(yī)藥級微生物菌劑。采用液體發(fā)酵微生物菌劑是目前行業(yè)發(fā)展的大趨勢。但是，液體發(fā)酵后的產(chǎn)物如以水劑做為產(chǎn)品形態(tài)，存在著產(chǎn)品保質(zhì)期短、包裝和運(yùn)輸費(fèi)用高等問題。目前一般是將發(fā)酵液經(jīng)一系列工藝處理后，得到粉劑的產(chǎn)品。主要工藝有1、離心法用高速離心機(jī)將菌體離下后，加入載體混勻后干燥粉碎。此工藝的缺點(diǎn)是不但會對菌體造成損傷，代謝產(chǎn)物如酶等活性物質(zhì)也無法同時(shí)獲 取。2、沉淀法發(fā)酵液加絮凝劑或調(diào)節(jié)pH值利用等電點(diǎn)沉淀法沉淀菌體，菌體沉淀后，去上清液，菌泥加入載體混勻后干燥粉碎。此工藝的缺點(diǎn)是易引起雜菌污染，并且如果添加絮凝劑，會使菌粉中殘留絮凝劑形成污染，菌劑的使用范圍受限。等電點(diǎn)沉淀法上清液殘留的菌體和代謝物較多。3、過濾法微孔濾膜過濾是近幾年新發(fā)展起來的一種微生物細(xì)胞收集方法，用微孔濾膜過濾后，收集菌泥，菌泥加入載體混勻后干燥粉碎。此工藝的缺點(diǎn)是處理成本高，濾膜易堵塞，影響處理效率。并且代謝產(chǎn)物同樣不能有效收集。4、噴霧干燥發(fā)酵液直接噴霧干燥，得到菌粉。此工藝的缺點(diǎn)是能耗特別大，菌活性低。除噴霧干燥外，其他工藝還都存在產(chǎn)物提取后的廢水處理困難的問題。
本公司的發(fā)明專利生物活性蒙脫石粉的制備方法及其作為動物飼料添加劑的應(yīng)用(專利申請?zhí)?01110042591.5)涉及到液體發(fā)酵產(chǎn)物的提取方法的優(yōu)化，但只針對用于飼料添加的產(chǎn)品，吸附劑也僅限于蒙脫石粉。
公開號為CN101554204A，名稱為一種發(fā)酵乳酸桿菌制劑的發(fā)明專利中，應(yīng)用礦物載體沸石粉提高乳酸菌的生物活性，但是屬于發(fā)酵后加入。
以多孔、微孔材料做為活性污泥載體處理污水，目前應(yīng)用較多，如《水工業(yè)工程設(shè)計(jì)手冊》(聶梅生，1999年9月，P644-653。)中提及將活性炭作為微生物載體，利用其優(yōu)異的吸附性能，使輕度污染廢水中的有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行富集濃縮以達(dá)到微生物生長代謝的基質(zhì)件件，通過自然馴化形成微生物體系。但將活性炭、沸石等用于微生物菌劑的發(fā)酵生產(chǎn)，提高培養(yǎng)基質(zhì)的利用率，在國內(nèi)文獻(xiàn)中還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
[0007]本發(fā)明的目的在于改進(jìn)現(xiàn)有液體發(fā)酵工藝產(chǎn)物提取難度大，能耗高的問題；本發(fā)明的目的還在于降低發(fā)酵廢水中有機(jī)物的含量，降低發(fā)酵廢水處理費(fèi)用，或者獲取產(chǎn)物后，直接回用于產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)，使發(fā)酵廢水零排放；本發(fā)明的目的還在于通過加入礦物載體，提高培養(yǎng)基質(zhì)的利用率，提高單位體積發(fā)酵液的菌含量；本發(fā)明的目的還在于所獲得產(chǎn)品不但含有微生物活菌體，還有細(xì)菌素、酶等代謝產(chǎn)物，提高產(chǎn)品的使用價(jià)值。
利用本發(fā)明的工藝生產(chǎn)微生物制劑，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、單位體積內(nèi)菌含量提高30 %以上，產(chǎn)物得率高。
2、菌體和代謝產(chǎn)物吸附到載體上，形成團(tuán)粒，可快速自然沉淀。
3、培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)利用率高，上清液廢水有機(jī)物含量降低70%以上。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
1、制作種子液。種子液的制取采用常規(guī)的逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，種子液的量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1-10%。
所述菌種包括細(xì)菌和酵母菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、粘乳產(chǎn) 堿桿菌、裂腈無色桿菌、殺鮭氣單胞菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、啤酒酵母等，包括但不限于以上舉例菌種。
2、發(fā)酵系統(tǒng)空消。按常規(guī)方法對空氣過濾系統(tǒng)和發(fā)酵罐進(jìn)行高溫消毒。
3、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的成分根據(jù)菌種的不同，包括但不限于以下成分中的一種或多種，如蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、玉米漿、硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀、尿素、淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、水蘇糖、糖蜜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸銨、硫酸亞鐵、硫酸錳、硼酸、鑰酸鈉、硫酸鋅、硫酸銅等。
按培養(yǎng)基體積的0. 01-1%加入消泡劑。
培養(yǎng)基的pH根據(jù)菌種的最佳生長條件,加以確定。
發(fā)酵培養(yǎng)基的量占發(fā)酵罐容積的65-75%。
4、培養(yǎng)基中加入吸附性載體，根據(jù)載體的不同，每升液體培養(yǎng)基加入1-700克，吸附性載體包括但不限于下面舉例中的一種或多種。如活性炭、沸石、麥飯石、海泡石、活性土、硅藻土、蒙脫石、凹土或其他一切人造多孔并具生物親和性的吸附材料。優(yōu)選活性炭、沸石、蒙脫石、活性土做為吸附性載體。
所述載體需預(yù)先處理成微粉,其粒度小于IOOOum,優(yōu)選粒度小于IOum的載體。
所述載體優(yōu)選幾種物質(zhì)的組合物，包括但不限于以下組成成分和重量比活性炭1-10 %，沸石粉 5-70 %，蒙脫石粉 0. 5-10 %，硅藻土 1-10 %，活性土 10-40 %。
所述蒙脫石，優(yōu)選醫(yī)藥級蒙脫石生產(chǎn)藥用、飼料添加用益生菌。
5、物料的消毒，按常規(guī)方法對培養(yǎng)基進(jìn)行高溫消毒，消毒過程中，攪拌轉(zhuǎn)速為150-300r/min。
6、接種并發(fā)酵。當(dāng)培養(yǎng)基溫度降至30_45°C時(shí)，接入菌種。根據(jù)菌種不同，確定最佳培養(yǎng)條件。如果是好氧菌，發(fā)酵條件一般為發(fā)酵前期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 1-0. 5倍，發(fā)酵發(fā)酵后期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 5-1. 5倍。攪拌轉(zhuǎn)速為150-300rpm，罐內(nèi)壓力維持在0. 03-0. 05MPa之間，培養(yǎng)溫度為20_40°C，培養(yǎng)時(shí)間為20-50小時(shí)。發(fā)酵液的PH值根據(jù)菌種最適值進(jìn)行確定。如果是厭氧菌，發(fā)酵條件一般為通入除菌二氧化碳或氮?dú)猓S持罐內(nèi)壓力在0. 03-0. 05MPa之間，攪拌轉(zhuǎn)速為150_300rpm，培養(yǎng)溫度為20-40°C，培養(yǎng)時(shí)間為20-60小時(shí)。
7、加工發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵完成后，停止攪拌，維持罐內(nèi)壓力在0. 03-0. 05MPa之間，發(fā)酵液溫度降至4-10°C，在罐內(nèi)靜止沉淀?；?qū)l(fā)酵液導(dǎo)入到無菌儲液罐內(nèi)，維持罐內(nèi)壓力在0. 03-0. 05MPa之間，發(fā)酵液溫度降至4_10°C，在儲液罐內(nèi)靜止沉淀。沉淀6_36小時(shí)后，去上清液，沉淀物直接加載體混勻后干燥或制粒后干燥，或在離心機(jī)內(nèi)1000-3000rpm離心后，離心物加載體混勻后干燥或制粒后干燥。所述載體包括但不限于白炭黑、玉米淀粉、沸石粉、硅藻土。所述干燥方法包括但不限于真空干燥、真空冷凍干燥、沸騰干燥或流化床干燥。干燥溫度不高于65 °C。
8、發(fā)酵廢水的處理。除發(fā)酵產(chǎn)物的上清液，COD含量小于200mg/L，SS小于30mg/L,氨氮(以氮計(jì))小于15mg/L,總磷(以P計(jì))小于3mg/L。將上清液進(jìn)一步處理后,通臭氧消毒，可以做為中水，加以利用，也可以用來配制發(fā)酵培養(yǎng)基，循環(huán)使用。
所述要進(jìn)一步處理的上清液,是指上清液COD含量大于20mg/L, SS大于10mg/L,氨氮(以氮計(jì))大于5mg/L，總磷(以P計(jì))大于lmg/L。低于此標(biāo)準(zhǔn)的上清液可以直接用臭氧消毒后利用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
發(fā)酵培養(yǎng)基中添加粒度小于IOum的復(fù)合載體發(fā)酵枯草芽孢桿菌
具體步驟為
(1)4°C保存的凍干菌種或_80°C保存的液體菌種進(jìn)行活化。將枯草芽孢桿菌ACCC10619在事前準(zhǔn)備好的LB (蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化鈉5克/升)固體培養(yǎng)皿上劃線，然后放 置于設(shè)定為37°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)。
(2) 一級種子液的制備。從活化的培養(yǎng)皿上挑取典型均一的單菌落接種到事先準(zhǔn)備好的LB液體無菌培養(yǎng)基里，然后置于恒溫振蕩培養(yǎng)器里，設(shè)定溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)18小時(shí)。獲得一級種子液。
(3) 二級種子液的制備。首先將制作種子液的發(fā)酵系統(tǒng)的空氣過濾器、空氣管道和發(fā)酵罐用蒸汽進(jìn)行滅菌，然后將事先配制的種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡劑)導(dǎo)入發(fā)酵罐，用蒸氣將培養(yǎng)基滅菌，待冷卻至40°C時(shí)，將步驟2)制作的一級種子液按培養(yǎng)基體積的3%接入發(fā)酵罐。發(fā)酵條件為溫度37°C，轉(zhuǎn)速為120rpm，發(fā)酵前期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 1-0. 5倍，發(fā)酵發(fā)酵后期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 5-1. 5倍。罐內(nèi)壓力維持在0. 03MPa左右，培養(yǎng)18小時(shí)。
(4)發(fā)酵生產(chǎn)。
①將生產(chǎn)用發(fā)酵系統(tǒng)的空氣過濾器、空氣管道和發(fā)酵罐用蒸汽進(jìn)行滅菌。
②配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為蛋白胨15克/升，酵母浸粉5克/升，玉米淀粉7克/升(需先糊化)，磷酸二氫鉀(KH2PO4 H2O) 0. 3克/升，硫酸錳(MnSO4 H2O) 0. 02克/升，消泡劑0.1暈升/升。培養(yǎng)基的量為發(fā)酵罐容積的65%。
③將發(fā)酵培養(yǎng)基導(dǎo)入發(fā)酵罐，并按每升培養(yǎng)基450克的量加入粒度小于IOum的復(fù)合載體，載體組成為(重量比)沸石粉70%,活性炭5%,活性土 20%,娃藻土 5%。開動攪動電機(jī)，轉(zhuǎn)速為260rpm,通蒸汽進(jìn)行滅菌。[0039]④將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至40°C，按培養(yǎng)基量的5%接入二級種子液，發(fā)酵條件為通入精度為0. Olum高效空氣除菌過濾器過濾的除菌空氣，發(fā)酵前期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 1-0. 5倍，發(fā)酵發(fā)酵后期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 5-1. 5倍。罐內(nèi)壓力維持在0. 05MPa，攪動轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
(5)加工發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵完成后，罐壓保持0.03MPa，將發(fā)酵液的溫度快速降至IO0C，再靜止12小時(shí)，去上清液，取沉淀物離心，離心溫度控制在4°C，離心轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心后的物料按重量比1: 0.3的量加入白炭黑，用混合機(jī)攪拌勻均，35°C沸騰干燥，干燥后水份含量要低于8%。干燥物用粉碎機(jī)粉至過80目篩后，制得枯草芽孢桿菌菌粉。經(jīng)測定，每克菌粉所含活菌的量大于2X 109CFU。(6)處理發(fā)酵上清液。經(jīng)測定，上清液中COD含量為21mg/L，SS為9mg/L，氨氮(以氮計(jì))為4. 7mg/L，總磷(以P計(jì))為0. 9mg/L。將上清液通臭氧消毒后，可以做為中水，加以利用，也可以用來配制發(fā)酵培養(yǎng)基，循環(huán)使用。
實(shí)施例2
發(fā)酵培養(yǎng)基中添加粒度小于50um的復(fù)合載體發(fā)酵地衣芽孢桿菌
具體步驟為
(1)4°C保存的凍干菌種或_80°C保存的液體菌種進(jìn)行活化。將地衣芽孢桿菌CICC23584在事前準(zhǔn)備好的LB固體培養(yǎng)皿上劃線，然后放置于設(shè)定為35°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
(2) 一級種子液的制備。從活化的培養(yǎng)皿上挑取典型均一的單菌落接種到事先準(zhǔn)備好的LB液體無菌培養(yǎng)基里，然后置于恒溫振蕩培養(yǎng)器里，設(shè)定溫度為32°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)22小時(shí)。獲得一級種子液。
(3) 二級種子液的制備。首先將制作種子液的發(fā)酵系統(tǒng)的空氣過濾器、空氣管道和發(fā)酵罐用蒸汽進(jìn)行滅菌，然后 將事先配制的種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡劑)導(dǎo)入發(fā)酵罐，用蒸氣將培養(yǎng)基滅菌，待冷卻至40°C時(shí)，將步驟2)制作的一級種子液按培養(yǎng)基體積的7%接入發(fā)酵罐。發(fā)酵條件為溫度37°C，轉(zhuǎn)速為120rpm，發(fā)酵前期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 1-0. 5倍，發(fā)酵發(fā)酵后期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 5-1. 5倍。罐內(nèi)壓力維持在0. 03MPa左右，培養(yǎng)18小時(shí)。
(4)發(fā)酵生產(chǎn)。
a、將生產(chǎn)用發(fā)酵系統(tǒng)的空氣過濾器、空氣管道和發(fā)酵罐用蒸汽進(jìn)行滅菌。
b、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為蛋白胨10. Og/L,牛肉膏10. Og/L,丙酸鈉 3. Og/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4 H2O) 0. 5g/L，硫酸鎂(MgSO4 7H20) 0. 2g/L，硫酸錳(MnSO4 H2O) 0. 005g/L，消泡劑0.1毫升/升，pH水為自來水，。培養(yǎng)基的量為發(fā)酵罐容積的 70%。
C、將發(fā)酵培養(yǎng)基導(dǎo)入發(fā)酵罐，并按每升培養(yǎng)基470克的量加入粒度小于50um的復(fù)合載體，載體組成為(重量比)沸石粉35%，活性炭25%，蒙脫石20%，硅藻土 20 %。開動攪動電機(jī)，轉(zhuǎn)速為270rpm,通蒸汽進(jìn)行滅菌。
d、將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至40°C，按培養(yǎng)基量的0.8%接入二級種子液，發(fā)酵條件為通入精度為0. Olum高效空氣除菌過濾器過濾的除菌空氣，發(fā)酵前期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 1-0. 5倍，發(fā)酵發(fā)酵后期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 5-1. 5倍。罐內(nèi)壓力維持在0. 05MPa，攪動轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為56小時(shí)。[0052](5)加工發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵完成后，罐壓保持0.03MPa，將發(fā)酵液的溫度快速降至IO0C，再靜止12小時(shí)，去上清液，取沉淀物離心，離心溫度控制在4°C，離心轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心后的物料按重量比1: 0.3的量加入白炭黑，用混合機(jī)攪拌勻均，35°C沸騰干燥，干燥后水份含量要低于8%。干燥物用粉碎機(jī)粉至過80目篩后，制得地衣芽孢桿菌菌粉。經(jīng)測定，每克菌粉所含活菌的量大于I X 109CFU。
(6)處理發(fā)酵上清液。經(jīng)測定，上清液中COD含量為37mg/L，SS為12mg/L，氨氮(以氮計(jì))為4. lmg/L,總磷(以P計(jì))為0. 7mg/Lo將上清液通臭氧消毒后，可以做為中水，加以利用，也可以用來配制發(fā)酵培養(yǎng)基，循環(huán)使用。
實(shí)施例3
發(fā)酵培養(yǎng)基中添加粒度小于50um的沸石粉發(fā)酵施氏假單胞菌
具體步驟為
(1)4°C保存的凍干菌種或_80°C保存的液體菌種進(jìn)行活化。將施氏假單胞菌CICC23621在事前準(zhǔn)備好的LB固體培養(yǎng)皿上劃線，然后放置于設(shè)定為30°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
(2) 一級種子液的制備。從活化的培養(yǎng)皿上挑取典型均一的單菌落接種到事先準(zhǔn)備好的LB液體無菌培養(yǎng)基里，然后置于恒溫振蕩培養(yǎng)器里，設(shè)定溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)22小時(shí)。獲得一級種子液。
(3) 二級種子液的制備。首先將制作種子液的發(fā)酵系統(tǒng)的空氣過濾器、空氣管道和發(fā)酵罐用蒸汽進(jìn)行滅菌，然后將事先配制的種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡劑)導(dǎo)入發(fā)酵罐， 用蒸氣將培養(yǎng)基滅菌，待冷卻至40°C時(shí)，將步驟2)制作的一級種子液按培養(yǎng)基體積的5%接入發(fā)酵罐。發(fā)酵條件為溫度30°C，轉(zhuǎn)速為120rpm，發(fā)酵前期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 1-0. 5倍，發(fā)酵發(fā)酵后期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的
0.5-1. 5倍，罐內(nèi)壓力維持在0. 03MPa左右，培養(yǎng)18小時(shí)。
(4)發(fā)酵生產(chǎn)。
a、將生產(chǎn)用發(fā)酵系統(tǒng)的空氣過濾器、空氣管道和發(fā)酵罐用蒸汽進(jìn)行滅菌。
b、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為蛋白胨10. Og/L，酵母浸粉10. Og/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4 H2O) 0. 5g/L，硫酸鎂(MgSO4 7H20) 0. 2g/L，消泡劑 0.1 毫升 / 升，pH 水為自來水，。培養(yǎng)基的量為發(fā)酵罐容積的70%。
C、將發(fā)酵培養(yǎng)基導(dǎo)入發(fā)酵罐，并按每升培養(yǎng)基500克的量加入粒度小于50um的沸石粉，開動攪動電機(jī)，轉(zhuǎn)速為230rpm，通蒸汽進(jìn)行滅菌。
d、將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至35°C，按培養(yǎng)基量的1. 5%接入二級種子液，發(fā)酵條件為通入精度為0. Olum高效空氣除菌過濾器過濾的除菌空氣，發(fā)酵前期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 1-0. 5倍，發(fā)酵發(fā)酵后期每分鐘通氣量為培養(yǎng)基體積的0. 5-1. 5倍，罐內(nèi)壓力維持在0. 05MPa，攪動轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為56小時(shí)。
(5)加工發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵完成后，罐壓保持0.03MPa，將發(fā)酵液的溫度快速降至IO0C，再靜止12小時(shí)，去上清液，取沉淀物離心，離心溫度控制在4°C，離心轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心后的物料按重量比1: 2的量加入玉米淀粉，用混合機(jī)攪拌勻均，35°C沸騰干燥，干燥后水份含量要低于8%。干燥物用粉碎機(jī)粉至過80目篩后，制得地施氏假單胞菌菌粉。經(jīng)測定，每克菌粉所含活菌的量大于2X 108CFU。[0066](6)處理發(fā)酵上清液。經(jīng)測定，上清液中COD含量為23mg/L，SS為7mg/L，氨氮(以氮計(jì))為4. lmg/L,總磷(以P計(jì))為0. 7mg/Lo將上清液通臭氧消毒后，可以做為中水，力口以利用，也可以用來配制發(fā)酵培養(yǎng)基，循環(huán)使用。
實(shí)施例4
發(fā)酵培養(yǎng)基中添加復(fù)合載體發(fā)酵植物乳桿菌
具體步驟為
(I)、4°C保存的凍干菌種或_80°C保存的液體菌種進(jìn)行活化。將植物乳桿菌CGMCC1.19在事前準(zhǔn)備好的MRS固體培養(yǎng)皿上劃線，然后放置于設(shè)定為35°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
(2)、一級種子液的制備。從活化的培養(yǎng)皿上挑取典型均一的單菌落接種到事先準(zhǔn)備好的MRS液體無菌培養(yǎng)基里，然后置于恒溫振蕩培養(yǎng)器里，設(shè)定溫度為32°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)22小時(shí)。獲得一級種子液。
(3)、二級種子液的制備。首先將制作種子液的發(fā)酵系統(tǒng)的空氣過濾器、空氣管道和發(fā)酵罐用蒸汽進(jìn)行滅菌，然后將事先配制的種子培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡劑)導(dǎo)入發(fā)酵罐，用蒸氣將培養(yǎng)基滅菌，待冷卻至40°C時(shí)，將步驟2)制作的一級種子液按培養(yǎng)基體積的5%接入發(fā)酵罐。發(fā)酵條件為溫度30°C，轉(zhuǎn)速為120rpm，過入無菌二氧化碳?xì)怏w，罐內(nèi)壓力維持在0. 03MPa左右，培養(yǎng)22小時(shí)。
(4)、發(fā)酵生產(chǎn)。
a、將生產(chǎn)用發(fā)酵系統(tǒng)的空氣過濾器、空氣管道和發(fā)酵罐用蒸汽進(jìn)行滅菌。
b、配制發(fā)酵培養(yǎng) 基，培養(yǎng)基配方為大豆蛋白胨5. Og/L,牛肉膏5. Og/L,酵母粉 2. Og/L,葡萄糖 5. Og/L,無水乙酸鈉 5. Og/L,檸檬酸氫二銨[(NH4) 2HC6H507] 0. 5g/L，Tween 801. 0g/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4 H2O) 0. 5g/L，硫酸鎂(MgSO4 7H20) 0. 2g/L，硫酸錳(MnSO4 -H2O) 0. 05g/L,碳酸鈣(CaCO3) 5. Og/L,消泡劑0.1毫升/升，pH為6. 8，水為自來水。培養(yǎng)基的量為發(fā)酵罐容積的75%。
C、將發(fā)酵培養(yǎng)基導(dǎo)入發(fā)酵罐，并按每升培養(yǎng)基370克的量加入粒度小于Ium的復(fù)合載體，載體組成為(重量比)沸石粉65%，活性炭5%，蒙脫石5%，硅藻土 5%，麥飯石20。開動攪動電機(jī),轉(zhuǎn)速為270rpm,通蒸汽進(jìn)行滅菌。
d、將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至35°C，按培養(yǎng)基量的2%接入二級種子液，發(fā)酵條件為通入精度為0. Olum高效空氣除菌過濾器過濾的除菌二氧化碳，罐內(nèi)壓力維持在0. 05MPa，攪動轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
(5)加工發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵完成后，罐壓保持0. 03MPa,將發(fā)酵液的溫度快速降至IO0C，再靜止24小時(shí)，去上清液，取沉淀物離心，離心溫度控制在4°C，離心轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心后的物料按重量比1: 0.3 : 0.1的量加入白炭黑和乳糖，拌勻均，40°C真空干燥，干燥后水份含量要低于8%。干燥物用粉碎機(jī)粉至過80目篩后，制得本發(fā)明所述的植物乳桿菌菌粉。經(jīng)測定，每克菌粉所含益生菌的量大于5X109CFU。
(6)處理發(fā)酵上清液。經(jīng)測定，上清液中COD含量為27mg/L，SS為llmg/L，氨氮(以氮計(jì))為3mg/L,總磷(以P計(jì))為0. 2mg/Lo將上清液通臭氧消毒后，可以做為中水，加以利用，也可以用來配制發(fā)酵培養(yǎng)基，循環(huán)使用。
權(quán)利要求
1.一種微生物菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入吸附性載體，載體組成為(重量比)沸石粉65%，活性炭5%，蒙脫石5%，硅藻土 5%，麥飯石20%，載體需預(yù)先處理成微粉，其粒度小于10 U m,然后與培養(yǎng)基一起高溫滅菌，滅菌后將培養(yǎng)基溫度冷卻至30-45°C，接入菌種，按菌株的適宜繁殖條件進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完成后，活菌體及代謝產(chǎn)物被吸附在載體上，靜止后很快沉淀，收集沉淀物進(jìn)行干燥或?qū)⒊恋砦镏屏：蟾稍铩?br>2.如權(quán)利要求
1所述的微生物菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于所述菌種為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、粘乳產(chǎn)堿桿菌、裂腈無色桿菌、植物乳桿菌、或嗜酸乳桿菌。
專利摘要
本發(fā)明涉及微生物菌劑的清潔高效生產(chǎn)方法。在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入吸附性載體，如活性炭、沸石、麥飯石、海泡石、活性土、硅藻土、蒙脫石、凹土或其他一切人造多孔性吸附材料中的一種或多種，與培養(yǎng)基一起高溫滅菌，冷卻到適宜的溫度后，接入菌種，按菌株的適宜繁殖條件進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完成后，活菌體及代謝產(chǎn)物被吸附在載體上，靜止后很快沉淀，收集沉淀物進(jìn)行干燥或?qū)⒊恋砦镏屏：蟾稍?。收集發(fā)酵產(chǎn)物后的上清液經(jīng)消毒后可以做為中水使用，或者用來配制培養(yǎng)基，循環(huán)使用。
文檔編號C12N1/00GKCN102212476 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110053903
公開日2013年4月3日 申請日期2011年3月7日
發(fā)明者黃海智, 邱曉力, 儲衛(wèi)華, 黃麗麗, 陳瑞 申請人:杭州向天歌生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan