專(zhuān)利名稱(chēng):一種流式電穿孔裝置及系統(tǒng)的制作方法
—種流式電穿孔裝置及系統(tǒng)技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及一種流式電穿孔裝置，更具體而言，本發(fā)明涉及一種高效地利用流式電穿孔裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔的系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
[0002]細(xì)胞膜是包圍在細(xì)胞外周的一層薄膜，是細(xì)胞與外界進(jìn)行選擇性物質(zhì)交換的通透性屏障。細(xì)胞膜使細(xì)胞成為一個(gè)獨(dú)立的生命單位，并擁有一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。周?chē)h(huán)境中的一些物質(zhì)可以通過(guò)細(xì)胞膜，其它的物質(zhì)則不行。細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞膜從周?chē)h(huán)境攝取養(yǎng)料，排出代謝產(chǎn)物，使物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到平衡狀態(tài)。所以，細(xì)胞膜的基本功能就是維持細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定并有選擇地與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換。[0003]研究發(fā)現(xiàn)，如果對(duì)細(xì)胞施加一定強(qiáng)度的電刺激并持續(xù)一段時(shí)間，就可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜上產(chǎn)生一些微孔，使細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，所謂細(xì)胞電穿孔(Electroporation)就是指細(xì)胞在外加脈沖電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜脂雙層上形成瞬時(shí)微孔的生物物理過(guò)程(Waver J. C. “Electroporation :A dramatic,nothermal electric field phenomenon，，1992)。當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生電穿孔時(shí)，其通透性和膜電導(dǎo)會(huì)瞬時(shí)增大，使親水分子、DNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、 藥物顆粒等正常情況下不能通過(guò)細(xì)胞膜的分子得以進(jìn)入細(xì)胞。在短時(shí)間內(nèi)撤除電刺激后， 細(xì)胞膜可以自我恢復(fù)，重新成為選擇性通透屏障。與傳統(tǒng)的化學(xué)穿孔和病毒穿孔相比，由于電穿孔具有無(wú)化學(xué)污染、不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成永久性損傷、效率較高等優(yōu)點(diǎn)，在生物物理學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。[0004]雖然電穿孔作用的機(jī)理并不完全清楚，但在本文中細(xì)胞電穿孔是公知的，包括細(xì)胞膜脂雙層的破裂，導(dǎo)致在膜上形成暫時(shí)性的微孔，允許外源性分子通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。[0005]現(xiàn)有技術(shù)中，主要有三類(lèi)方法來(lái)完成細(xì)胞電穿孔的過(guò)程[0006]I將細(xì)胞放置于一對(duì)相距數(shù)毫米至數(shù)厘米的平行電極之間。使細(xì)胞在電極之間的電場(chǎng)中受到電刺激，以實(shí)現(xiàn)電穿孔的目的。(例如，美國(guó)專(zhuān)利U. S. Pat. 5389069)[0007]2使用微型針狀電極扎入組織或細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電擊，達(dá)到電穿孔的目的。(例如，美國(guó)專(zhuān)利U. S. Pat. 5389069 ;中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)號(hào)CN 101020892A)[0008]3將一個(gè)腔室放置在一對(duì)平行電極之間，使得細(xì)胞的懸浮溶液在腔室中流動(dòng)的同時(shí)受到電擊。[0009](例如，美國(guó)專(zhuān)利U.S.Pat. 6773669 ;中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)號(hào)CN 1195997A)在現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的電穿孔設(shè)備及方法大部分不適用于處理大量的樣品，也不適用于連續(xù)處理樣品。也就是說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)中得到的電穿孔室均是“靜態(tài)”工作的，即在電穿孔室處理完一批樣品以后，需要對(duì)電穿孔室進(jìn)行清洗、重新加入細(xì)胞等處理，才能繼續(xù)下一批樣品處理。在公開(kāi)的技術(shù)中，電穿孔常常是 在一次性單室試管中進(jìn)行的，其用于電穿孔的最大容量通常為I毫升。在需要處理大量樣品的場(chǎng)合中，這種技術(shù)冗長(zhǎng)乏味，勞動(dòng)強(qiáng)度大。研究人員在此基礎(chǔ)上，發(fā)明了多個(gè)電穿孔腔并聯(lián)的形式，這種技術(shù)有其優(yōu)點(diǎn)，但卻不能根本解決難以實(shí)現(xiàn)快速處理大量樣品的困難。[0010]在需要電穿孔處理大量樣品時(shí)，也可采用一種半連續(xù)流式系統(tǒng)(Flow through system)(例如，美國(guó)專(zhuān)利U. S. Pat. 5676646),在此系統(tǒng)中，需要電穿孔的樣品被注入電穿孔室，并且施加電脈沖穿孔。然后，將該電穿孔室抽空并根據(jù)需要重新注入多次以對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。在這種系統(tǒng)中，由于電極之間的距離通常在10毫米左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)胞的典型尺度(10微米)，所以難以精確控制實(shí)際施加在細(xì)胞上的電場(chǎng)。同時(shí)，在兩個(gè)平板電極產(chǎn)生的電場(chǎng)中，電場(chǎng)E = V/D(V為施加在兩極板之間的電壓，D為兩極板之間的距離)，在極板之間的距離D較大(10毫米)的傳統(tǒng)流式電穿孔系統(tǒng)中，需要的電壓通常高達(dá)數(shù)千伏特。這給設(shè)計(jì)供電系統(tǒng)增加了難度，也不利于節(jié)能環(huán)保。同時(shí)，這種系統(tǒng)并不是完全連續(xù)工作的，需要對(duì)電穿孔室進(jìn)行加注-電穿孔-抽空-再加注-電穿孔的操作。這種工作方式減低了效率，不能實(shí)現(xiàn)真正的高通量操作。[0011]通過(guò)在小型流體通道的內(nèi)部放置精密加工的電極，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)電場(chǎng)分布的精確控制，從而實(shí)現(xiàn)相對(duì)較高的穿孔效率和處理速度。然而，在此類(lèi)系統(tǒng)中，電極直接和細(xì)胞懸浮液接觸，在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔的過(guò)程中，不可避免地會(huì)發(fā)生水的電解現(xiàn)象。伴隨水的電解產(chǎn)生的是大量的熱量、氣泡以及細(xì)胞懸浮液PH值的劇烈改變，以上這些現(xiàn)象會(huì)顯著降低細(xì)胞的存活率并破壞流道中電場(chǎng)的均勻性從而降低細(xì)胞的穿孔效率。[0012]流體動(dòng)力學(xué)聚焦(Hydrodynamic Focusing)技術(shù)是目前在流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer)等設(shè)備中廣泛應(yīng)用的一種多層流體控制技術(shù)。根據(jù)流體動(dòng)力學(xué)原理，在小型流體通道等典型的低雷諾數(shù)(Reynolds Number)狀態(tài)下,流體呈現(xiàn)層流狀態(tài),并不會(huì)相互混合(J. B. Knight, “Hydrodynamic Focusing on a Silicon Chip Mixing Nano liters in Microseconds”, 1998)。利用該原理,可以通過(guò)設(shè)計(jì)具有多個(gè)入口通道并匯聚成一條主通道的小型流體通道，將不同的流體通過(guò)不同的流道注入，從而控制任意一層流體的厚度。雖然流體動(dòng)力學(xué)聚焦的效果和實(shí)現(xiàn)方法隨流體通道設(shè)計(jì)的不同而不同，但在本文中流體動(dòng)力學(xué)聚焦技術(shù)是公知的，包括小型流體通道中的低雷諾數(shù)流體、具有多個(gè)流體入口的小型流體通道、可控的流體分層厚度。
發(fā)明內(nèi)容
[0013]本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的之一是提供了一種電穿孔裝置，該裝置具有基于流體動(dòng)力學(xué)聚焦技術(shù)設(shè)計(jì)的小型流體通道以及放置在該通道中的電極；本發(fā)明的另一目的是提供一套完整的流式電穿孔系統(tǒng)。[0014]為了達(dá)到上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明所提供的流式電穿孔裝置的技術(shù)方案概述如下[0015]一種流式電穿孔裝置，包括[0016]基板，以及制作在基板上的電極，所述的電極，是平行并成對(duì)放置的，每對(duì)電極包括相對(duì)設(shè)置的陽(yáng)極和陰極；[0017]置于電極之上的限制流體流動(dòng)的通道；所述通道起始端具有多個(gè)入口分支通道， 并匯聚成一條主通道，結(jié)束端具有多個(gè)出口分支通道，所述通道上方設(shè)置具有多個(gè)流體入口及出口的頂蓋。[0018]所述通道由絕緣材 料制成。[0019]所述的絕緣材料為玻璃或者硅。[0020]所述的通道由PDMS或者有機(jī)聚合物制成。[0021]所述的通道寬度為5微米至10毫米。[0022]所述的通道在起始端具有I至10個(gè)入口分支通道，在結(jié)束端具有I至10個(gè)出口分支通道。[0023]所述的基板，由絕緣材料或?qū)щ姴牧细采w表面絕緣材料制成。[0024]所述的絕緣材料為玻璃或者娃或者塑料。[0025]所述的電極，由導(dǎo)電材料制成。[0026]所述的導(dǎo)電材料為金。[0027]所述的電極，平行于流體通道成對(duì)放置。[0028]所述的頂蓋，由絕緣材料或?qū)щ姴牧细采w表面絕緣材料制成。[0029]所述的絕緣材料為玻璃或者娃或者塑料。[0030]為了達(dá)到上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明所提供的流式電穿孔系統(tǒng)的技術(shù)方案概述如下[0031]一種流式電穿孔系統(tǒng)，包括[0032]流式電穿孔裝置，其中包括[0033]基板，以及制作在基板上的電極，所述的電極，是平行并成對(duì)放置的，每對(duì)電極包括相對(duì)設(shè)置的陽(yáng)極和陰極；[0034]置于電極之上的限制流體流動(dòng)的通道；所述通道起始端具有多個(gè)入口分支通道， 并匯聚成一條主通道，結(jié)束端具有多個(gè)出口分支通道，所述通道上方設(shè)置具有多個(gè)流體入口及出口的頂蓋；[0035]注射泵，由管道連接到所述流式電穿孔裝置中頂蓋的入口及出口，用于控制流體的流速；[0036]電壓源，由電連接件連接電極，用于設(shè)定并產(chǎn)生脈沖電壓。[0037]該電穿孔系統(tǒng)用于對(duì)流體中的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，所述的細(xì)胞包括動(dòng)物細(xì)胞或者細(xì)菌，所述的動(dòng)物細(xì)胞包括原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞。[0038]該電穿孔系統(tǒng)用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔時(shí)，設(shè)定的脈沖電壓為I 2000V，脈沖寬度 O. 05 20暈秒，脈沖間隔O.1 60秒，流體的流速O 10暈升/分鐘。[0039]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是[0040]流式電穿孔系統(tǒng)利用流體通道以及相連接的注射泵來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞懸浮液在流體通道中的連續(xù)流動(dòng)，從而使細(xì)胞被電穿孔的過(guò)程能夠持續(xù)進(jìn)行。這樣就可以實(shí)現(xiàn)快速處理大量樣品。同時(shí)，可以通過(guò)在一個(gè)流式電穿孔系統(tǒng)中集成多個(gè)流式電穿孔裝置的方式來(lái)成倍提高處理速度。[0041]在采用半導(dǎo)體刻蝕等微細(xì)加工方法的條件下，相比于已公開(kāi)的電穿孔設(shè)備及系統(tǒng)，可以將電極的尺寸和電極之間的距離都縮小很多，同時(shí)，流 體通道的尺寸也可以縮小到和電極尺寸相配合的程度。這樣，就可以用相對(duì)于已公開(kāi)的技術(shù)來(lái)說(shuō)要小得多的電壓來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞電穿孔的目的。從而降低設(shè)備成本并節(jié)能。[0042]利用流體動(dòng)力學(xué)聚焦技術(shù)，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了不同液體在流體通道中的分層流動(dòng)。使用導(dǎo)電的電穿孔緩沖液，將細(xì)胞懸浮液和電極隔開(kāi)。在本發(fā)明中，細(xì)胞不直接和電極接觸，從而避免了發(fā)生在電極區(qū)域的由電解水產(chǎn)生的有害效應(yīng)(包括氣泡、發(fā)熱以及PH值的改變等)對(duì)細(xì)胞的傷害，大大提高了細(xì)胞的存活率。同時(shí)，通過(guò)提高電穿孔緩沖液的電導(dǎo)率，可以用相對(duì)較小的電壓在細(xì)胞流過(guò)的區(qū)域形成電穿孔所需的電場(chǎng)強(qiáng)度[0043]縮小的電極間距還帶來(lái)了一個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)，就是更高的電穿孔效率。因?yàn)榧?xì)胞懸浮液是不均勻的，電極間距越小，就意味著電極之間的不均勻溶液越少，也就越容易控制電穿孔條件的一致性，達(dá)到高電穿孔效率。[0044]平行于流道放置的電極可以在電場(chǎng)中產(chǎn)生一個(gè)均勻的電場(chǎng)分布，細(xì)胞全部在這個(gè)均勻的電場(chǎng)區(qū)域內(nèi)流過(guò)，從而得到均一可控的高效細(xì)胞電穿孔。[0045]在一些實(shí)施例中，采用玻璃或聚合物等透明材料來(lái)制作基板，此時(shí)，就可以通過(guò)顯微鏡來(lái)實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞在電穿孔過(guò)程中的變化。對(duì)于細(xì)胞生理學(xué)研究來(lái)說(shuō)，這是顯著的優(yōu)勢(shì)。


[0046]圖1是流式電穿孔裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；[0047]圖2是沿圖1中AA’以及BB’的部分剖視圖；[0048]圖3是流式電穿孔裝置的分解視圖；[0049]圖4是流體通道4的示意圖；[0050]圖5是電極6的示意圖；[0051]圖6是流式電穿孔系統(tǒng)的各部分連接示意圖；[0052]圖中，1-頂蓋；2-流體通道入口 ；3_流體通道出口 ；4_流體通道；5-基板；6-電極；7_流體通道中的主通道；8_流體通道起始端的一個(gè)分支入口通道；9_流體通道起始端的另一個(gè)分支入口流道；10_流體通道起始端的細(xì)胞分支入口通道；11_流體通道結(jié)束端的一個(gè)分支出口通道；12_流體通道結(jié)束端的另一個(gè)分支出口通道；13_流體通道結(jié)束端的細(xì)胞分支出口通道；14_成對(duì)電極對(duì)中的一個(gè)電極；15_成對(duì)電極對(duì)中的另一個(gè)電極；16_流式電穿孔系統(tǒng)中的一個(gè)流式電穿孔裝置；17_流式電穿孔系統(tǒng)中的另一個(gè)流式電穿孔裝置；18_流式電穿孔系統(tǒng)中的電壓發(fā)生器；19_流式電穿孔系統(tǒng)中的注射泵；20_電纜連線； 21-電穿孔緩沖液入口密封管道；22_細(xì)胞懸浮液入口密封管道。
具體實(shí)施方式
[0053]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述[0054]I 基板[0055]因?yàn)榛迤?到承托作用和在電極之間起絕緣隔離作用，所以基板需要由絕緣材料制成，或者由非絕緣材料覆蓋絕緣層制成。根據(jù)本發(fā)明的基板可有任何適合以上條件的固體基板來(lái)制成，優(yōu)選的基板是那些可以通過(guò)鑄?；驒C(jī)器切割制成要求規(guī)格的基板。特別優(yōu)選的是透明的玻璃或者聚合物，因?yàn)樵谶@種情況下，可以通過(guò)顯微鏡實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的狀態(tài)。[0056]在圖2所示的優(yōu)選實(shí)施例中，基板采用普通玻璃制成，長(zhǎng)8厘米、寬2. 5厘米、高I 毫米。該基板的尺寸可由具體需求決定，并通過(guò)切割等方法得到所需尺寸的基板。[0057]在其它實(shí)施例中，基板材料也可以采用硅，陶瓷或覆蓋了絕緣層的金屬。由于這些材料的加工技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，因而本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實(shí)施中方便的采用這些材料。[0058]2 電極[0059]電極可以由適當(dāng)?shù)膶?dǎo)電材料或這些材料的復(fù)合物來(lái)制成。優(yōu)選材料為生物兼容性好的材料，例如金、鈦和摻有銀離子的PDMS (聚二甲基硅氧烷，一種常用的聚合物)。當(dāng)采用多種材料時(shí)(例如一種導(dǎo)電材料(例如金)鍍?cè)诹硪环N導(dǎo)電材料(例如銅)上)，最外層的優(yōu)選材料為生物兼容性好的材料。[0060]在如圖2所示的實(shí)施例中，電極材料為鉻和金。首先在基板上濺射(這是一種半導(dǎo)體加工工藝中公知的沉積金屬的方法)一層厚度為O.1微米的鉻，再濺射一層厚度為O. 5 微米的金。然后對(duì)整個(gè)基板進(jìn)行光刻(同樣是半導(dǎo)體加工工藝中公知的制作圖形的方法) 得到需要的電極形狀。接著腐蝕掉金層和鉻層上不需要的部分。最終得到所需的電極。當(dāng)然，電鍍等本領(lǐng)域公知的加工金屬的方法也可以用來(lái)制造電極。[0061]本實(shí)施例采用鉻和金來(lái)制作電極，是因?yàn)榻饹](méi)有生物毒性，而鉻是為了增加金和玻璃之間的黏附性。在不同的需求下，其它的導(dǎo)電材料，例如鋁、銅或者導(dǎo)電聚合物都可以用來(lái)制造電極。[0062]如圖2所示的實(shí)施例中，電極的高度為O. 6微米，這是考慮到電極之上的流體通道需要和基板實(shí)現(xiàn)密封，在本實(shí)施例中，這種密封是通過(guò)鍵合(半導(dǎo)體加工工藝中公知的將兩種物質(zhì)緊密結(jié)合在一起的方法)實(shí)現(xiàn)的，所以，電極的高度不宜過(guò)大以妨礙密封。已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)確定的是當(dāng)采用鍵合密封時(shí)，電極高度從O.1微米到10微米都是合適的。當(dāng)采用熱壓、粘合劑粘合等其它密封方式時(shí)，則不存在電極高度的限制，所以，電極高度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)不同的需求和加工方法來(lái)確定。[0063]如圖2所示的實(shí)施例中，電極的寬度為100微米，電極之間的距離為500微米，這種尺寸的電極所產(chǎn)生的電場(chǎng)是人胚胎腎細(xì)胞電穿孔條件的最優(yōu)選電場(chǎng)。當(dāng)需要對(duì)其它細(xì)胞進(jìn)行電穿孔時(shí)，可以本領(lǐng)域技術(shù)人員自行選擇合適的電極寬度和電極間距。[0064]3流體通道[0065]流體通道的作用是約束流體的流動(dòng)，使細(xì)胞懸浮液按特定的軌跡流經(jīng)電極區(qū)域， 受到電場(chǎng)的作用，從而完成細(xì)胞電穿孔的過(guò)程。流體通道可以由任何適合加工成形的絕緣材料制成，或在非絕緣材料的表面覆蓋一層絕緣層。優(yōu)選的，流體通道的材料應(yīng)是生物兼容性好的材料。[0066]如圖2所示的實(shí)施例中，采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)來(lái)制作流體通道，這是一種公知的常用于生物器件領(lǐng)域的易于加工成型的生物兼容聚合物材料。所述PDMS流體通道是通過(guò)鑄模的方法來(lái)得到，使用硅片充當(dāng)模具。首先在普通半導(dǎo)體加工用硅片上利用光刻， 腐蝕等工藝制作出相應(yīng)的凹槽，然后將液態(tài)的PDMS溶液澆鑄進(jìn)硅片上的凹槽，待其凝固后將其脫模取出，就得到了成型的流體通道。當(dāng)然，流體通道也可以采用玻璃、塑料、其它聚合物等材料并使用本領(lǐng)域所公知的一些加工方法進(jìn)行加工，例如使用激光刻蝕玻璃形成流體通道。[0067]如圖2所示的實(shí)施例中，流體通道通過(guò)鍵合的方法和基板連接在一起。這是考慮到PDMS和玻璃之間極易通過(guò)鍵合來(lái)形成牢固的密封，而PDMS和玻璃之間的鍵合過(guò) 程也很簡(jiǎn)單，只需要將PDMS和玻璃的表面用高壓激發(fā)的氧等離子處理10秒左右(這是為了激發(fā) PDMS和玻璃表面的懸掛鍵)，然后施加一定的壓力將其壓緊。靜置24小時(shí)后即形成可靠牢固的密封。對(duì)于其它不同的應(yīng)用，本領(lǐng)域公知的連接方法也都適用，例如使用粘合劑將流體通道和基板密封連接在一起。[0068]在圖4所示中，在流體通道中設(shè)計(jì)了多個(gè)入口和出口以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞懸浮液的流體動(dòng)力學(xué)聚焦。流體通道的起始端具有3個(gè)入口分支通道用于通入不同的流體，結(jié)束端具有 3個(gè)出口分支通道用于不同的流體流出。所有的分支通道匯聚成一條主通道。入口分支通道的寬度分別為1. 2暈米、O. 6暈米、1. 2暈米；出口通道的寬度分別為O. 5暈米、O. 2暈米、 O. 5毫米；主流道的寬度為1. 2毫米，長(zhǎng)度為30毫米。所有流道的高度都為80微米。和電極的尺寸設(shè)計(jì)一樣，這組尺寸也是為人胚胎腎細(xì)胞電穿孔而設(shè)置的最優(yōu)選條件。在其它應(yīng)用中，本領(lǐng)域研究人員可以自行設(shè)置尺寸以滿(mǎn)足不同的需求，比如在該方面的優(yōu)選實(shí)施例中，主流體通道布置成直線形，以使細(xì)胞懸浮液的流動(dòng)方向垂直于電場(chǎng)方向，從而使細(xì)胞受到適當(dāng)時(shí)間的電刺激。根據(jù)不同細(xì)胞的要求，在另一些實(shí)施例中，主流體通道布置成多匝的線圈形，延長(zhǎng)細(xì)胞在流道中通過(guò)的時(shí)間，以使細(xì)胞受到更長(zhǎng)時(shí)間的電場(chǎng)作用。在其它的一些實(shí)施例中，主流體通道可以布置為環(huán)形，以適應(yīng)細(xì)胞電泳分離等特別要求。在本文所述小型流體通道中，主流體通道寬度為5微米至10毫米都是可行的，同時(shí)，I至10個(gè)入口分支通道及I至10個(gè)出口分支通道也都是可行的。[0069]4 頂蓋[0070]頂蓋的作用是通過(guò)和流體通道的密封連接來(lái)共同實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞懸浮液的約束，并為通道提供入口和出口。任何絕緣材料或覆蓋了絕緣材料的固體材料都可以用來(lái)制作頂蓋。 頂蓋可以使用和流體通道相同的材料并和流體通道一起制造及同時(shí)一次成型。[0071]如圖1所示流式電穿孔裝置的結(jié)構(gòu)，包括頂蓋I ;流體通道入口 2和出口 3 ;頂蓋下方的流體通道4(該圖中不可見(jiàn)具體流道布置)；流道下方的電極6(該圖中不可見(jiàn)具體電極布置)；電極下方的基板5。為了更清楚地看出頂蓋的結(jié)構(gòu)，如圖2所示剖面圖，可以看出頂蓋的結(jié)構(gòu)，可以采用激光打過(guò)孔的玻璃來(lái)制作頂蓋。與前述理由相同，這是為了利用玻璃容易切割、打孔并易于和PDMS材料制作的流體通道之間形成牢固的密封連接。在其它應(yīng)用中，可以采用塑料、聚合物等易于加工的絕緣材料，也可以采用表面覆蓋了絕緣材料的不銹鋼等金屬。如圖2所示的剖面圖，可以看出流體通道的結(jié)構(gòu)和電極的部分結(jié)構(gòu)。[0072]整個(gè)流體電穿孔裝置的各個(gè)部件及安裝，如圖3所示，基板5位于最底層，其上方置電極6，將流體通道4放在電極6上面，并與基板5鍵合在一起，流體通道4上面制作有頂蓋1，并留有流體通道入口 2和出口 3。[0073]流體通道的設(shè)計(jì)如圖4所示，兩側(cè)的電穿孔緩沖液分支入口通道8、9和中央的細(xì)胞分支入口通道10匯聚而成主流體通道7。主流體通道分岔成為兩側(cè)的電穿孔緩沖液分支出口通道11、12和中央的細(xì)胞分支出口通道13。[0074]電極的設(shè)置方式如圖5所示，電極14和15在流體通道下方平行成對(duì)放置并引出流道外。5流式電穿孔系統(tǒng)及實(shí)驗(yàn)方法[0075]如圖6所示，流式電穿孔系統(tǒng)除了兩個(gè)流式電穿孔裝置16、17之外，整套系統(tǒng)還需要一個(gè)電壓源18和與之相配的電纜連線20、一臺(tái)注射泵19和與之相配的密封管道21、22 以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞懸浮液的受控流動(dòng)。所述電壓源、電纜連線、注射泵及密封管道都是公開(kāi)的和本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲取的設(shè)備。[0076]在如圖6所示的 系統(tǒng)中，采用電壓源輸出為正負(fù)100伏特的電壓源，而采用的注射泵可控的流速為O到10毫升每分鐘。這也是為人胚胎腎細(xì)胞電穿孔而設(shè)置的最優(yōu)選條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇相似設(shè)備。根據(jù)需要，電壓為I至2000伏特、脈沖寬度為O. 05至20毫秒、脈沖間隔為O. 4-60秒的電脈沖都是可行的。[0077]本系統(tǒng)中并行連接了兩個(gè)流式電穿孔裝置，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇I 至1000個(gè)流式電穿孔裝置并行連接以實(shí)現(xiàn)更高的處理速度。[0078]本電穿孔裝置可以電穿孔動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌，優(yōu)選的細(xì)胞系有HEK293(人胚胎腎細(xì)胞)，Hela(人宮頸癌細(xì)胞)，H印G2(人肝癌細(xì)胞)，Neim)-2A(小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞)， Jurkat (人淋巴瘤細(xì)胞)，HL60(人原髓細(xì)胞)和MDCK(狗腎上皮細(xì)胞)；優(yōu)選的原代細(xì)胞有=HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，DRG(大鼠背要神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)，T淋巴細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞； 優(yōu)選的細(xì)菌有大腸桿菌，巴氏桿菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇不同的細(xì)胞。[0079]本電穿孔系統(tǒng)可以通過(guò)電穿孔的方法使多種不同的高分子化合物進(jìn)入細(xì)胞，包括核酸類(lèi)(質(zhì)粒DNA，線性DNA，小干擾RNA，反義核酸)，蛋白類(lèi)(肽段，抗體)。優(yōu)選的質(zhì)粒是真核表達(dá)載體(PEGFP-C3)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇各種真核，原核表達(dá)載體使用。[0080]本系統(tǒng)可以顯著提高本領(lǐng)域現(xiàn)有電穿孔技術(shù)的樣品處理速度，實(shí)現(xiàn)高通量電穿孔。[0081]系統(tǒng)中的電壓源可以對(duì)不同細(xì)胞給出不同波形的電壓，在圖6所示的系統(tǒng)中，優(yōu)選采用方波脈沖。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)不同的細(xì)胞選擇合適的電壓源輸出。[0082]電穿孔實(shí)驗(yàn)中用到的緩沖液取自由KC1(氯化鉀)，KH2PO4(磷酸二氫鉀)， K2HPO4(磷酸氫二鉀)，糖類(lèi)和水組成的組。對(duì)于圖2所示的實(shí)施例，優(yōu)選的緩沖液配方為 1000毫升緩沖液中含KCl (15-50毫摩爾)，KH2PO4 (O. 1-2毫摩爾)，K2HPO4 (O. 1-2毫摩爾)， 肌醇(20-60毫摩爾)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)電穿孔細(xì)胞的不同而調(diào)整各組分的濃度以取得最聞的穿孔效率。[0083]6具體制造步驟[0084]由如下兩套不同的制作工藝已經(jīng)成功制造出了本發(fā)明所述裝置及系統(tǒng)。給出具體制作方法是為了幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的制造方法，而并不是對(duì)本發(fā)明所述器件的材料，尺寸和制造方法做出限定。[0085]制作方法A [0086]采用半導(dǎo)體制造工藝常用的4英寸玻璃片。在玻璃片上濺射O.1微米厚的鉻金屬層，再在鉻金屬層上濺射O. 5微米厚的金層。對(duì)玻璃片進(jìn)行光刻，制造出所需電極的形狀， 然后再使用碘化鉀溶液腐蝕金層，使用硝酸鈰銨溶液腐蝕鉻層。然后將玻璃片按長(zhǎng)8厘米， 寬2. 5厘米的形狀用砂輪切割。這樣就得到了基板及其上的電極。采用N型4英寸硅片， 在光刻出流道的平面形狀后，使用半導(dǎo)體常用的ICP干法刻蝕(感應(yīng)等離子刻蝕，即使用六氟化硫和四氟化碳的高能等離子來(lái)刻蝕硅)出80微米深的槽。將液態(tài)PDMS倒入槽中，待其凝固后脫模取出。將其按長(zhǎng)7. 5厘米，寬2厘米的形狀用刀片切割并在合適的位置打孔， 這樣就得到了流體通道和相應(yīng)的頂蓋。將玻璃基板的表面和PDMS流體通道表面用氧等離子處理后，緊貼在一起并施加壓力，靜置24小時(shí)，即得到流式電穿孔裝置。[0087]使用兩個(gè)流式電穿孔裝置，使用普通塑料管連接真空泵和兩個(gè)流式電穿孔裝置的流體入口，之間使用紫外固化粘合劑密封。在裝置基板上外露的金電極上通過(guò)超聲波 焊接進(jìn)行電纜的引出，將兩個(gè)流式電穿孔裝置引出的電纜同時(shí)連接到電壓源上，即可完成整套流式電穿孔系統(tǒng)的搭建。[0088]制作方法B [0089]采用半導(dǎo)體制造工藝常用的4英寸N型硅片。在硅片上濺射O.1微米厚的鉻金屬層，再在鉻金屬層上電鍍5微米厚的金層。對(duì)硅片進(jìn)行光刻，制造出所需電極的形狀，然后再使用碘化鉀溶液腐蝕金層，使用硝酸鈰銨溶液腐蝕鉻層。然后將硅片按長(zhǎng)8厘米，寬2. 5 厘米的形狀用砂輪切割。這樣就得到了基板及其上的電極。采用普通玻璃片，厚度I毫米， 使用激光在其上按尺寸加工出流體通道。將玻璃片按長(zhǎng)7. 5厘米，寬2厘米的形狀用砂輪切割，這樣就得到了流體通道。采用普通聚四氟乙烯塑料，用激光打孔作為流體進(jìn)口和出口。 將塑料片按長(zhǎng)7. 5厘米，寬2厘米的形狀用砂輪切割。用紫外固化粘合劑將硅基板、玻璃流體通道以及塑料頂蓋粘合在一起，即得到流式電穿孔裝置。[0090]使用兩個(gè)流式電穿孔裝置，使用普通塑料管連接真空泵和兩個(gè)流式電穿孔裝置的流體入口，之間使用紫外固化粘合劑密封。在裝置基板上外露的金電極上通過(guò)超聲波焊接進(jìn)行電纜的引出，將兩個(gè)流式電穿孔裝置引出的電纜同時(shí)連接到電壓源上，即可完成整套流式電穿孔系統(tǒng)的搭建。[0091]7具體電穿孔方法[0092]由如下的電穿孔方法已經(jīng)對(duì)本發(fā)明所述裝置和系統(tǒng)進(jìn)行了成功的電穿孔實(shí)驗(yàn)。給出具體電穿孔方法是為了幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解電穿孔裝置的使用方法，而 并不是對(duì)本發(fā)明所述裝置的適用范圍做出限定。[0093]收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293 (人胚胎腎細(xì)胞)，以轉(zhuǎn)速800轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，用電穿孔緩沖液(每100毫升中含氯化鉀15毫摩爾，磷酸二氫鉀O. 3毫摩爾，磷酸氫二鉀O. 85毫摩爾，肌醇56毫摩爾)重懸細(xì)胞，使得細(xì)胞的密度為2X103個(gè)/微升，加入需要通過(guò)電穿孔進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒PEGFP-C3，使質(zhì)粒的濃度為20微克/毫升，輕柔混合均勻。將混合好的細(xì)胞懸液100微升加入微量進(jìn)樣器中(上海高鴿牌，容量為250微升)，微量進(jìn)樣器通過(guò)軟管連接在流式電穿孔裝置流體通道中央的細(xì)胞分支入口通道上。將微量進(jìn)樣器安裝在注射泵上，調(diào)節(jié)注射泵，使得流速為4微升/分鐘。將不含有細(xì)胞的電穿孔緩沖液250微升加入另一個(gè)微量進(jìn)樣器中(上海高鴿牌，容量為250微升)，該微量進(jìn)樣器通過(guò)軟管連接在流式電穿孔裝置流體通道兩側(cè)的電穿孔緩沖液分支入口通道上。將該微量進(jìn)樣器安裝在另一個(gè)注射泵上，調(diào)節(jié)注射泵，使得流速為18微升/分鐘。可以在主流體通道中觀察到細(xì)胞懸浮液被成功壓縮為寬度約2. 2毫米的一層流體，并處于穩(wěn)定的層流狀態(tài)下。當(dāng)細(xì)胞懸液開(kāi)始在通道中流動(dòng)時(shí)，施加電脈沖刺激。電刺激的條件為電壓80V，脈沖寬度O. 2ms，脈沖間隔2秒。[0094]電穿孔結(jié)束后，通過(guò)軟管將細(xì)胞懸浮液引入96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件溫度 370C，二氧化碳濃度5%。24小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察，可成功觀察到90%以上的細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)，表明電穿孔的轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。此后使用PI (Propidium Iodide，碘化丙啶)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察到少于20%的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，表明細(xì)胞存活率達(dá)80%以上。
權(quán)利要求
1.一種流式電穿孔裝置，包括基板，以及制作在基板上的電極，所述的電極，是平行并成對(duì)放置的，每對(duì)電極包括相對(duì)設(shè)置的陽(yáng)極和陰極；置于電極之上的限制流體流動(dòng)的通道；所述通道起始端設(shè)置有細(xì)胞通道和位于細(xì)胞通道兩側(cè)的緩沖液通道，并匯聚成一條主通道，結(jié)束端具有多個(gè)出口分支通道，所述通道上方設(shè)置具有多個(gè)流體入口及出口的頂蓋；所述主通道的寬度為5微米至10毫米；所述電極位于緩沖液通道內(nèi)。
2.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述通道由絕緣材料制成。
3.如權(quán)利要求
2所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的絕緣材料為玻璃或者硅。
4.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的通道由有機(jī)聚合物制成。
5.如權(quán)利要求
4所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的通道由PDMS制成。
6.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的通道在起始端具有I至10個(gè)入口分支通道，在結(jié)束端具有I至10個(gè)出口分支通道。
7.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的基板，由絕緣材料或?qū)щ姴牧细采w表面絕緣材料制成。
8.如權(quán)利要求
7所述的電穿孔裝置,其特征在于,所述的絕緣材料為玻璃或者娃或者塑料。
9.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的電極，由導(dǎo)電材料制成。
10.如權(quán)利要求
9所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的導(dǎo)電材料為金。
11.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的電極，平行于流體通道成對(duì)放置。
12.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的頂蓋具有I至10個(gè)入口，I至10個(gè)出口。
13.如權(quán)利要求
1所述的電穿孔裝置，其特征在于，所述的頂蓋，由絕緣材料或?qū)щ姴牧细采w表面絕緣材料制成，并和流體通道采用相同的材料并同時(shí)一次成型。
14.一種流式電穿孔系統(tǒng)，其特征在于，包括流式電穿孔裝置，包括基板，以及制作在基板上的電極，所述的電極，是平行并成對(duì)放置的，每對(duì)電極包括相對(duì)設(shè)置的陽(yáng)極和陰極；置于電極之上的限制流體流動(dòng)的通道；所述通道起始端設(shè)置有細(xì)胞通道和位于細(xì)胞通道兩側(cè)的緩沖液通道，并匯聚成一條主通道，結(jié)束端具有多個(gè)出口分支通道，所述通道上方設(shè)置具有多個(gè)流體入口及出口的頂蓋；所述主通道的寬度為5微米至10毫米；所述電極位于緩沖液通道內(nèi)；注射泵，由管道連接到所述流式電穿孔裝置中頂蓋的入口及出口，用于控制流體的流速；電壓源，由電連接件連接電極，用于設(shè)定并產(chǎn)生脈沖電壓。
15.如權(quán)利要求
14所述的電穿孔系統(tǒng)，其特征在于，該系統(tǒng)并行連接I至1000流式電穿孔裝置。
16.如權(quán)利要求
14所述的電穿孔系統(tǒng)，其特征在于，該電穿孔系統(tǒng)用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔時(shí)，設(shè)定的脈沖電壓為I 2000伏，脈沖寬度O. 05 20毫秒，脈沖間隔O.1 60秒，各流體 通道入口的流體流速O 10毫升/分鐘。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種流式電穿孔裝置及系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括流式電穿孔裝置，其中包括基板，以及制作在基板上的電極，所述的電極，是平行并成對(duì)放置的，每對(duì)電極包括相對(duì)設(shè)置的陽(yáng)極和陰極；置于電極之上的限制流體流動(dòng)的通道；所述通道起始端具有多個(gè)入口分支通道，并匯聚成一條主通道，結(jié)束端具有多個(gè)出口分支通道，所述通道上方設(shè)置具有多個(gè)流體入口及出口的頂蓋；注射泵，由管道連接到所述流式電穿孔裝置中頂蓋的入口及出口控制流體的流速；電壓源，由電連接件連接電極設(shè)定并產(chǎn)生脈沖電壓。流式電穿孔系統(tǒng)利用流體通道以及相連接的注射泵來(lái)實(shí)現(xiàn)各種懸浮液在流體通道中的連續(xù)流動(dòng)，從而使細(xì)胞被電穿孔的過(guò)程能夠持續(xù)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)快速處理大量樣品。
文檔編號(hào)C12M1/42GKCN101928666 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010242144
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2010年7月30日
發(fā)明者李志宏, 梁子才, 魏澤文, 黃璜 申請(qǐng)人:北京大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2), 非專(zhuān)利引用 (1),