一種手持電穿孔裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種手持電穿孔裝置，包括手持結(jié)構(gòu)、電極組件、對位套，所述的手持結(jié)構(gòu)包括電源線、電極伸縮旋按鈕、電源開關(guān)、顯示器、參數(shù)控制按鍵；所述的電極組件包括立體電極陣列、電極固定組件；所述電極固定組件包括電極連接板和電極定位板，所述電極插入到所述電極定位板中；所述電極連接板能夠?qū)㈦姌O組件和手持結(jié)構(gòu)形成電連接。本發(fā)明的電穿孔裝置中的電極組件可拆卸，便于清洗和更換不同類型的電極，其中手持的設計與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有設計合理、結(jié)構(gòu)簡單、易加工、成本低等特點，操作簡單快捷，實用性強，適用于實驗室高通量、高效率處理細胞，具有很好的推廣使用價值。
【專利說明】—種手持電穿孔裝置
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細胞電穿孔裝置，特別是涉及一種可拆卸的、可更換電極的、手持的立體電極裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]自從1970年代電穿孔技術(shù)就被用于將分子插入到動物細胞或植物細胞內(nèi)，研究者證實，細胞暴露于短暫持續(xù)的高壓電場中能使胞膜上形成通道，大分子如蛋白質(zhì)和DNA可通過該通道進入細胞內(nèi)。這些通道被稱為電孔洞，是由高壓電場造成的細胞膜局部破裂引起的通透性升高區(qū)。這些孔洞的存在時間雖然短暫，但足以滿足大分子如質(zhì)粒DNA分子進入細胞的需要。細胞雖然能夠耐受這些孔洞的形成，但如果形成的孔洞過多過大，其產(chǎn)生的過程以及由此導入的分子也可能會殺死細胞。
[0003]最早是用最簡單的帶平行板電容器進行電穿孔，彼此相對的電極之間可產(chǎn)生基本均勻的電場。將準備進行電穿孔的細胞懸液與操作者希望將其導入到細胞內(nèi)的分子混合置于兩個電極之間，在電極上通以一次或多次短時間的高壓電場脈沖，從而達到分子通過電穿孔導入到細胞內(nèi)的效果。但平行板電極之間的間距較大，所需要的電壓通常都高達數(shù)千伏，無可避免的會產(chǎn)生陰極效應，對細胞產(chǎn)生巨大傷害。
[0004]之后出現(xiàn)的平面電極雖然解決了電壓過高帶來的負面作用，但是每次能夠處理的細胞量很小，不適合于高通量的實驗操作。立體式電極容易刺入組織和活體，多用于腫瘤或活體組織等臨床方向的電穿孔，其電穿孔效率并不高，對于體外的細胞電穿孔如懸浮細胞或貼壁細胞的報道較少。
[0005]CN101553180A公開了一種用于破壞癌細胞的裝置和方法，該方法包括向組織傳送電場，包括將電極定位在包括癌細胞的目標組織區(qū)域內(nèi)，并對目標組織施加交變電流以非熱消融電極周圍目標組織區(qū)域的癌細胞。
`[0006]CN103275874A公開了高密度分布式立體電極裝置，所述裝置采用分組復用的電極，能夠最大程度的彌補立體電極造成的電場不均，能夠單次處理毫升級的細胞，在孔板和流式裝置中均能使用，能避免了高電壓對細胞的傷害，成本低，是一種高通量、高效率的細胞電穿孔裝置。
[0007]雖然上述現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了一種立體式電極，但是在實際使用過程中，其使用的電極固定柱會限制該電極的使用，并且由于該立體式電極結(jié)構(gòu)過于簡單導致使用時難以控制穩(wěn)定性，在電穿孔時操作不方便。
[0008]本發(fā)明為了克服上述缺陷，主要解決的技術(shù)問題是提供一種結(jié)構(gòu)簡單、準確對位，易于加工制造的可拆卸的、可更換電極陣列的手持電穿孔裝置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明包括一種向液體傳送電場的方法，該方法包括將多個電極設置在具有懸浮細胞的目標液體內(nèi)。多個電極可包括第一電極和多個第二電極。該方法還包括對該液體施加交流電以提供從液體內(nèi)徑向向外延伸的電場，從而達到對液體中的細胞實現(xiàn)電穿孔的目的。
[0010]本發(fā)明提供一種可拆卸的手持立體電穿孔裝置，包括手持結(jié)構(gòu)、電極組件、對位套，其特征在于，所述的手持結(jié)構(gòu)包括電源線、電極伸縮旋按鈕、電源開關(guān)、顯示器、參數(shù)控制按鍵；
[0010]所述的電極組件包括可拆卸的電極陣列、電極固定組件；
[0011]所述的電極組件包括可拆卸的電極陣列、電極固定組件；所述電極固定組件包括電極連接板和電極定位板，所述電極連接板將只施加同一極性的電脈沖對應的電極連接到一起，所述電極插入到所述電極定位板中；
[0012]所述可拆卸的電極陣列固定在所述電極固定組件上，所述電極陣列包括多個電極，所述多個電極包括絕緣部分和/或非絕緣部分，所述多個電極包括針或柱狀電極，所述多個電極包括直或彎曲的電極，所述彎曲的電極包括彎曲部分或有曲率半徑的部分；所述多個電極上按時間周期分別施加第一極性的電脈沖和第二極性的電脈沖，其中，所述第一極性的電脈沖對應的電極的周圍分布的都是第二極性的電脈沖對應的電極；
[0013]所述電極連接板能夠?qū)㈦姌O組件和手持結(jié)構(gòu)形成電連接，并固定在電極伸縮旋按鈕的另一端、優(yōu)選地，電極組件上的電極連接板能夠嵌入手持結(jié)構(gòu)中的與電極伸縮旋按鈕連接的接口。所述對位套能夠套在手持結(jié)構(gòu)底部，方便用戶在多孔板上快速對位。
[0014]優(yōu)選地，所述電極陣列中的多個電極按正多邊形排列、圓柱形排列、扇形排列、環(huán)形排列、球形排列、螺旋形排列、螺線形排列、同心螺旋線排列，所述電極陣列中相鄰的兩個電極之間的距離相等。
[0015]優(yōu)選地，所述電極陣列的形狀為由若干等邊三角形組成的正多邊形，所述電極位于所述等邊三角形的頂點上。
[0016]優(yōu)選地，所述第一極性為正極，所述第二極性為負極。
[0017]優(yōu)選地，所述第一極性為負極，所述第二極性為正極。
[0018]優(yōu)選地，所述電極的材料為形狀記憶金屬或彈簧鋼。
[0019]優(yōu)選地，所述電極的材料選自不銹鋼、鉬、金、銀、銅、或其他導電材料。
[0020]優(yōu)選地，所述電極的直徑為0.01-1.2mm，所述兩個相鄰電極中心點之間的距離為0.1-2.4mm,所述電極的個數(shù)為大于19根。
[0021]優(yōu)選地，所述電極的直徑為0.1-0.4mm，所述兩個相鄰電極中心點之間的距離為0.2-1.5mm,所述電極的個數(shù)為大于36根。
[0022]優(yōu)選地，所述電極的直徑為0.3mm，所述兩個相鄰電極中心點之間的距離為1mm，所述電極的個數(shù)為37根。
[0023]優(yōu)選地，所述電極陣列中的電極分為若干組，所述同一組的電極只施加同一極性的電脈沖，以所述電極陣列的其中一組為正極施加電脈沖，其余組為負極施加電脈沖，再以另一組為正極施加電脈沖，其余組為負極施加電脈沖，如此交替，將得到的電場疊加得到均勻的電場。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益的效果是:本發(fā)明的手持電穿孔裝置中的電極組件可拆卸，便于清洗和更換不同類型的電極，其中手持的設計與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有設計新穎獨特、結(jié)構(gòu)簡單、易加工、成本低等特點，操作簡單快捷，實用性強，適用于實驗室選擇性高通量、高效率處理細胞，具有很好的推廣使用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1示出根據(jù)本發(fā)明實施例的側(cè)視圖。
圖2示出根據(jù)本發(fā)明實施例的俯視圖。
圖3示出根據(jù)本發(fā)明實施例的電極伸出狀態(tài)。
圖4示出根據(jù)本發(fā)明實施例的電極收縮狀態(tài)。
圖5示出根據(jù)本發(fā)明實施例的電源主機。
圖6是圖1所述立體電極裝置的正視圖；
圖7是圖1所述立體電極裝置中電極陣列的拓撲結(jié)構(gòu)圖；
圖8是所述立體電極裝置施加電脈沖時的電極分布圖；
圖 9 是 HEK-293A、Hela, MCF-7、A-375、Neuro_2A、U251、C2C12、3T3_L1、CHO, MDCK,HL-60、HUVEC用所述立體電極裝置施加不同電脈沖情況下的電穿孔亮場圖和熒光圖； 附圖中各部件的標記如下:1、電源線；2、電極伸縮旋按鈕；3、電源開關(guān)；4、顯示器；5、參數(shù)控制按鍵；6、電極陣列；7、對位套；8、對位柱；9、電源顯示屏；10、電源輸出接口 ；11螺栓，12、螺母，13、電極連接板，14、電極定位板。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被本領域技術(shù)人員理解，從而對本發(fā)明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
[0027]實施例一:
[0028]根據(jù)說明書附圖圖1至圖7，本發(fā)明提供一種可拆卸的立體電極裝置，包括手持結(jié)構(gòu)、可拆卸的電極組件、對位套；
[0029]所述的手持結(jié)構(gòu)包括電源線1、電極伸縮旋按鈕2、電源開關(guān)3、顯示器4、參數(shù)控制按鍵5 ;
[0030]所述的電源線與電源輸出接口 10連接形成電通路，電源線可以使用一般的電線。
[0031]所述的電極伸縮旋按鈕2能夠控制電極陣列伸縮的長度，按下旋按鈕后電極陣列伸出手持結(jié)構(gòu)的底端，按起旋按鈕后電極陣列縮回手持結(jié)構(gòu)的底端，旋轉(zhuǎn)旋按鈕時可以調(diào)節(jié)電極陣列伸出手持結(jié)構(gòu)的底端的長度。優(yōu)選的，順時針旋轉(zhuǎn)旋按鈕能夠控制電極陣列伸展，逆時針旋轉(zhuǎn)旋按鈕能夠縮回電極陣列，優(yōu)選的，旋按鈕旋轉(zhuǎn)的角度能夠滿足電極陣列剛好完全伸出對位套或完全縮回對位套。
[0032]所述的電源開關(guān)采用彈簧按鍵式，按下時形成通路，按起后電路斷開。
[0033]所述的參數(shù)控制按鍵能夠設置電脈沖時的電壓，頻率，電流，阻抗，溫度等參數(shù)。
[0034]所述的顯示器上顯示設置的電脈沖電壓，頻率，電流，溫度，阻抗等參數(shù)。
[0035]所述對位套7是一個可通過螺紋方便旋緊在手持端底部的一次罩形器件，對位套上有對位柱8，其用途是方便用戶在96孔板上快速對位，并避免手持端地板直接接觸孔板，照成樣品污染。
[0036]所述對位柱8能夠與多孔板的板孔之間的間隙相咬合以達到固定所述電極陣列6的作用。
[0037]所述的電極組件包括電極陣列6、電極固定組件；所述電極陣列6固定在所述電極固定組件上。
[0038]所述電極陣列6由實心的37根圓柱體電極組成，排列規(guī)則為所有的電極排列成正六邊形結(jié)構(gòu)，相鄰的兩個電極之間的間距都相等，以相鄰兩個電極之間的間距為邊長，將正六邊形內(nèi)部分成若干小的等邊三角形單元，每個等邊三角形的頂點放置一個電極，即所有的電極分為1、I1、III3組，每個等邊三角形單元的頂點分別屬于1、I1、III。
[0039]所述電極陣列6的正六邊形的內(nèi)徑與多孔板的板孔相匹配，兩個相鄰電極中心點之間的距離為1mm。兩個電極之間的間距影響電穿孔時的電壓，可以根據(jù)需要調(diào)整。在電極插入孔板中，離孔板底部的距離為0.lmm-lmm。
[0040]所述電極的直徑為0.3mm，直徑過大或者過小都會影響電穿孔效果。直徑過大時，電穿孔的有效電場面積會減少，使能夠電穿孔的細胞量減少，不利于高通量的細胞電穿孔。直徑過小，電極容易彎曲，使制作成本大大增加。
[0041 ] 所述電極的材料可選擇任意導電金屬和其他導電材料，其中不銹鋼電極是作為電極的極好的材料。所述不銹鋼材料具有良好的生物兼容性，容易清洗，不易氧化，容易做成較長的電極，能夠大批量生產(chǎn)并多次重復使用而不影響其導電特性。
[0042]所述電極固定組件包括電極連接板13和電極定位板14，兩個電極連接板13分別位于所述電極定位板14的上下部位，再用螺栓11和螺母12將所述電極連接板13和所述電極定位板14緊固在一起。
`[0043]由于所述電極比較長，而電穿孔技術(shù)對于電極間距精度要求很高，因此在進行電穿孔實驗時采用了雙層電極連接板13和電極定位板14對所述電極進行定位。由于所述雙層電極連接板13和所述電極定位板14的厚度約1cm，能夠?qū)λ鲭姌O進行長距離的約束和定位，因此能夠很準確的控制電極到達孔板底部的位置。所述可拆卸的手持立體電極裝置的支撐結(jié)構(gòu)能夠輕松的擴展，可以組成2*2、1*4、12*8等任意組合陣列的電極網(wǎng)絡，這樣靈活多樣的組合能夠最大程度的兼容多孔板結(jié)構(gòu)，方便用戶使用。
[0044]所述電極連接板13將同一組的電極通過焊接方式、導電膠或其他電學連接方式連在一起。可以采用PCB線路板，也可以是任何能夠完成規(guī)定線路連接的器件。所述電極定位板14用于電極定位，電極細長容易彎曲，使用所述電極定位板14能降低電極間距的不一致性，從而提高電場均勻性。
[0045]所述可拆卸的手持立體電極裝置可以為單孔的器件，可以組合成4個一組，也可以96個一組以配合生物常用的多孔板結(jié)構(gòu)，甚至更多來使用。
[0046]所述可拆卸的手持立體電極裝置的電穿孔方法為:在電穿孔時先以I作為正極，
I1、III作為負極施加電脈沖，得到的電場模擬分布如圖8中的tl所示，再以II作為正極，
1、III作為負極施加電脈沖，得到的電場模擬分布如圖8中的t2所示，然后以III作為正極，1、II作為負極施加電脈沖，得到的電場模擬分布如圖8中的t3所示。
[0047]對于某種特定的細胞，所加電場高于某一閾值的時候，細胞膜會出現(xiàn)開孔。當電場逐漸增加，細胞的死亡率會出現(xiàn)上升。為了保證細胞的高電穿孔率和低死亡率，需要將電場精確控制在電穿孔閾值電場。
[0048]圖8中的tl、t2、t3三個電場分布圖都顯示電場不均勻，因而當施加單一組合的脈沖時，必然會有部分細胞所受到的電場高于多數(shù)細胞或者低于多數(shù)細胞，電穿孔效率不會很高。但當三個不均勻的電場最大場強疊加在一起時，情況卻發(fā)生了變化。疊加后的電場如圖8中Max，可以看出電場在超過90 %以上的區(qū)域中的電場都是均勻的，這說明在全部區(qū)域內(nèi)的細胞接受到的最高電場是均勻的。因此只要控制所述均勻電場強度為電穿孔的最佳電穿孔電壓，整個有效區(qū)域內(nèi)的細胞都能最大程度的進行電穿孔。由此可見，分組復用彌補了單一分組造成的電場不均，提高了電穿孔效率，可以判斷這種組合電場的電穿孔效率會比傳統(tǒng)電穿孔效率高很多。
[0049]所述可拆卸的手持立體電極裝置能夠?qū)芏嗉毎颠M行懸浮或者貼壁的電穿孔。我們選用 7 HEK-293A、Hela, MCF-7、A-375、Neuro_2A、U251、C2C12、3T3_L1、CHO, MDCK,HL-60、HUVEC12種細胞進行電穿孔，使用GFP分子作為標志物。如果細胞被電穿孔，GFP分子會進入細胞，并且在細胞內(nèi)合成熒光物質(zhì)，合成的熒光物質(zhì)在熒光場下會發(fā)出綠色熒光，因此用熒光場中細胞的數(shù)量除以整個細胞數(shù)量可以得出細胞的電穿孔率，即同等密度細胞的熒光強度越大，電穿孔效率越高。
[0050]圖9為所述可拆卸的手持立體電極裝置進行生物實驗的結(jié)果。這12組電穿孔實驗結(jié)果的圖片中，左邊為細胞亮場圖，表示進行電穿孔的細胞數(shù)量。右圖為熒光場圖，反映細胞電穿孔的情況。通過亮場圖和熒光圖進行對比，可以得出細胞的存活率和電穿孔效率都可以高達80%以上。
[0051 ] 所述 可拆卸的手持立體電極裝置能應用在流式裝置中。將所述可拆卸的手持立體電極裝置置于流式的環(huán)境中，隨流動液體均勻分布流動的細胞經(jīng)過所述電極陣列時，經(jīng)流速和脈沖刺激的控制，使之接收最佳的電穿孔刺激條件，所述電穿孔刺激條件包括脈沖的電壓幅值、脈沖寬度、脈沖間隔、脈沖個數(shù)和電極交換控制。在持續(xù)流動系統(tǒng)中，除了在電極上施加脈沖的時間與細胞在電極之間開始流動的時間需要協(xié)調(diào)之外，脈沖與細胞流動之間不需要“期間處理”的協(xié)調(diào)。
[0052]所述可拆卸的手持立體電極裝置既有持續(xù)流式電穿孔的優(yōu)點，特別是能在無菌封閉系統(tǒng)內(nèi)對細胞進行高通量電穿孔，又能保證每個細胞都受到最佳次數(shù)的脈沖和最均勻的電場，以提高電穿孔的效率，并減少死亡率。
[0053]實施例二:
本發(fā)明提供一種可拆卸的手持電極裝置，其他結(jié)構(gòu)與實施例一相同，所述電極陣列的排列規(guī)則為所有的電極排列成正四邊形結(jié)構(gòu)，相鄰的兩個電極之間的間距都相等，以相鄰兩個電極之間的間距為邊長，將正四邊形內(nèi)部分成若干小的正方形單元，每個正方形的頂點放置一個電極，即所有的電極分為1、I1、II1、IV4組，每個正方形單元的頂點分別屬于1、
I1、II1、IV，以其中一組的電極作為正極，其余組的電極作為負極，輪流施加電脈沖。
[0054]實施例三:
本發(fā)明提供一種可拆卸的手持電極裝置，其他結(jié)構(gòu)與實施例一相同，所述電極陣列的排列規(guī)則為所有的電極排列成正六邊形結(jié)構(gòu)，相鄰的兩個電極之間的間距都相等，以相鄰兩個電極之間的間距為邊長，將平面成若干小的正六邊形單元，每個正六邊形單元的頂點放置一個電極，即所有的電極分為1、I1、II1、IV、V、VI6組，每個正六邊形單元的頂點分別屬于1、I1、II1、I V、V和VI，以其中一組的電極作為正極，其余組的電極作為負極，輪流施加電脈沖。
[0055]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的【技術(shù)領域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種手持電穿孔裝置，包括手持結(jié)構(gòu)、電極組件、對位套，其特征在于，所述的手持結(jié)構(gòu)包括電源線、電極伸縮旋按鈕、電源開關(guān)、顯示器、參數(shù)控制按鍵； 所述的電極組件包括立體電極陣列、電極固定組件； 所述的電極固定組件包括電極連接板和電極定位板，所述電極連接板將只施加同一極性的電脈沖對應的電極連接到一起，所述電極插入到所述電極定位板中；所述的立體電極陣列固定在所述電極固定組件上，所述電極陣列包括多個電極，所述多個電極包括絕緣部分和/或非絕緣部分，所述多個電極包括針和/或柱狀電極，所述多個電極包括直和/或彎曲的電極，所述彎曲的電極包括彎曲部分或有曲率半徑的部分。所述多個電極上按時間周期分別施加第一極性的電脈沖和第二極性的電脈沖，其中，所述第一極性的電脈沖對應的電極的周圍分布的都是第二極性的電脈沖對應的電極； 所述電極連接板能夠?qū)㈦姌O組件和手持結(jié)構(gòu)形成電連接，并固定在電極伸縮旋按鈕的另一端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述電極陣列中的多個電極按正多邊形排列或圓柱形排列，所述電極陣列中相鄰的兩個電極之間的距離相等。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于，所述電極陣列的形狀為由若干等邊三角形組成的正多邊形，所述電極位于所述等邊三角形的頂點上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述第一極性為正極，所述第二極性為負極。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述第一極性為負極，所述第二極性為正極。`
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述電極的材料為形狀記憶金屬或彈簧鋼。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，所述電極的材料包括不銹鋼、鉬、金、銀、銅、或其他導電材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的裝置，其特征在于，所述電極的直徑為0.01-1.2mm，所述兩個相鄰電極中心點之間的距離為0.1-2.4_，所述電極的個數(shù)為大于19根。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其特征在于，所述電極的直徑為0.1-0.4mm，所述兩個相鄰電極中心點之間的距離為0.2-1.5mm，所述電極的個數(shù)為大于36根。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其特征在于，所述電極的直徑為0.3mm，所述兩個相鄰電極中心點之間的距離為1mm，所述電極的個數(shù)為37根。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的裝置，其特征在于，所述電極陣列中的電極分為若干組，所述同一組的電極只施加同一極性的電脈沖，以所述電極陣列的其中一組為正極施加電脈沖，其余組為負極施加電脈沖，再以另一組為正極施加電脈沖，其余組為負極施加電脈沖，如此交替，將得到的電場疊加得到均勻的電場。
【文檔編號】C12M1/42GK103865794SQ201410100031
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】戴曉兵, 閆浩 申請人:蘇州文曲生物微系統(tǒng)有限公司