專利名稱:一種高效快速分離人頭皮毛囊中上皮細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞的分離，具體涉及人頭皮毛囊中上皮細(xì)胞的分離。
背景技術(shù)：
據(jù)2003年北京紅惠生物制藥公司對(duì)6000名25歲-49歲男性調(diào)查結(jié)果表明，隨年齡的增加雄激素性脫發(fā)的發(fā)病率也在增加。其中，25歲-29歲之間的發(fā)病率為12％，45歲-49歲之間的發(fā)病率為31％?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，毛囊中的上皮細(xì)胞可用來(lái)構(gòu)建組織工程化的毛囊，組織工程化的毛囊可用于毛發(fā)移植。但是，要構(gòu)建組織工程化的毛囊，就需要大量毛囊的上皮細(xì)胞。
目前從毛囊中分離上皮細(xì)胞的方法有以下幾種1.顯微分離法在顯微鏡下分用胰酶消化至外根鞘暴露，然后將單個(gè)毛囊接種到培養(yǎng)皿中(參見(jiàn)高強(qiáng)國(guó)，符剛，楊恬；小鼠觸須毛囊外根鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)及uPA和uPAR表達(dá)研究；第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)；2004；26(16)1452)。此方法由于要在顯微鏡下進(jìn)行單個(gè)毛囊分離的操作，分離速度慢，勞動(dòng)強(qiáng)度大，細(xì)胞易污染。
2.拔毛法從頭皮中直接拔出毛囊，經(jīng)胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞后培養(yǎng)?；蛘甙杨^皮經(jīng)膠原酶和胰酶混合液消化后拔出毛囊，置胰酶中消化成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)(參見(jiàn)Sotaro K，Satoshi I，IIirotoT.Successful transplantation of cultural human outer root sheath cells asepithelium.Annals Plastic Surgery，1994，33(3)290)。此方法也要在顯微鏡下進(jìn)行單個(gè)毛囊操作，也存在分離速度慢的不足。國(guó)知局2005年03年16日公開(kāi)了一種“快速粘附法分離富集毛囊干細(xì)胞”的發(fā)明專利申請(qǐng)(公開(kāi)號(hào)為CN1594554)，該專利申請(qǐng)所公開(kāi)方法也屬于這種拔毛法，仍同樣存在所述拔毛法的不足。
3.消化擠出法頭皮條在真皮皮下組織交界處剪開(kāi)后，用0.5％分離酶在4℃下消化16-18h，使表皮與真皮分離，然后從直皮和皮下組織中擠出毛囊上皮成份(參見(jiàn)伍津津，劉榮卿，葉慶佾等.人各段毛囊上皮細(xì)胞培養(yǎng)的增殖力比較；第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)；1999；21(11)788)。此方法對(duì)頭皮消化時(shí)間太長(zhǎng)，擠出的毛囊上皮成份不完整，不易收集。
由此可見(jiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中所述的毛囊上皮細(xì)胞的分離方法都是單個(gè)毛囊分離方法，不僅勞動(dòng)強(qiáng)度大，分離速度還慢，因此快速分離人頭皮毛囊中上皮細(xì)胞是本領(lǐng)域渴望解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是人頭皮毛囊中上皮細(xì)胞的快速分離。本發(fā)明具有整塊批處理、高效快速的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案依次包括以下步驟a.人頭皮的處理去除頭皮外毛發(fā)以及皮下組織中的脂肪和結(jié)締組織，制成0.3-0.5cm寬的皮條，先用2.5g/L的洗必泰溶液浸泡10-15min，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液震蕩洗滌三次；b.酶消化法消化除去表皮，破碎，在37℃下以100rpm速度攪拌并加入0.5％膠原酶I，攪拌2小時(shí)后懸液過(guò)800目篩，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液過(guò)濾洗滌截留于篩網(wǎng)上的毛干，收集后在25℃下加入0.075％的胰酶靜置20分鐘；c.培養(yǎng)基的配制在K-SFM培養(yǎng)基加入胎牛血清、胰島素、氫化可的松和慶大霉素，使每毫升K-SFM培養(yǎng)基里含有0.1ml胎牛血清、6ug胰島素、0.5ug氫化可的松和40ug慶大霉素；d.將c步驟所得的培養(yǎng)基加入b步驟所得的溶液中，以1000rmp速度離心3次，每次離心5分鐘，倒掉上清液，得到上皮細(xì)胞群；e.在培養(yǎng)器中預(yù)鋪濃度為1％的I型膠原，再將步驟d所得到的上皮細(xì)胞群接種到培養(yǎng)器中培養(yǎng)便得。
本發(fā)明所述的人頭皮為需要進(jìn)行毛發(fā)移植或需要進(jìn)行整形外科手術(shù)的患者的頭皮。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)器為規(guī)格為35mm的培養(yǎng)皿。
本發(fā)明所述的高效快速分離人頭皮毛囊中上皮細(xì)胞的方法對(duì)患者自體整塊頭皮進(jìn)行批處理，得到毛囊中的上皮細(xì)胞，具有勞動(dòng)強(qiáng)度低和分離效速度快的顯著效果。采用所述方法分離得到的上皮細(xì)胞可用于毛發(fā)的移植。
具體實(shí)施方式
以下是本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
和效果，但是這些實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限制。
實(shí)施例一1.剃除患者枕部毛發(fā)，標(biāo)記切取范圍，2×6cm，醫(yī)用酒精消毒3遍，用11號(hào)手術(shù)刀片沿標(biāo)記線切開(kāi)，深達(dá)筋膜層，取下頭皮，枕部切口用3-0絲線縫合；2.去除頭皮外毛發(fā)以及皮下組織中的脂肪和結(jié)締組織，制成0.3-0.5cm寬的皮條，先用2.5g/L的洗必泰溶液浸泡15min(溶液漫過(guò)皮條)，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液震蕩洗滌三次；
3.除去步驟2所得到頭皮的表皮，破碎，在37℃下以100rpm速度攪拌并加入0.5％膠原酶I，攪拌2小時(shí)后懸液過(guò)800目篩，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液過(guò)濾、洗滌截留于篩網(wǎng)上的毛干，收集后在25℃下加入0.075％的胰酶靜置20分鐘；4.在K-SFM培養(yǎng)基加入胎牛血清、胰島素、氫化可的松和慶大霉素，使每毫升K-SFM培養(yǎng)基里含有0.1ml胎牛血清、6ug胰島素、0.5ug氫化可的松和40ug慶大霉素；5.將4步驟所得的培養(yǎng)基加入3步驟所得的溶液中，以1000rmp速度離心3次，每次離心5分鐘，倒掉上清液，得到上皮細(xì)胞群；6.在35mm的培養(yǎng)皿中預(yù)鋪濃度為1％的I型膠原，再將步驟5所得到的上皮細(xì)胞群接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
所用的0.5％的膠原酶I、0.075％的胰酶、I型膠原均購(gòu)自Sigma公司；所用的K-SFM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，胰島素購(gòu)于徐州邦聯(lián)制藥，氫化可的松購(gòu)于江蘇揚(yáng)州制藥廠，慶大霉素購(gòu)于徐州邦聯(lián)制藥公司，洗必泰溶液購(gòu)于華北制藥有限公司，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液是購(gòu)于微佳公司的高壓滅菌的磷酸鹽緩沖液實(shí)施例二1.按實(shí)施例一的步驟1，得到1×3cm大小的頭皮；2.去除頭皮外毛發(fā)以及皮下組織中的脂肪和結(jié)締組織，制成0.3-0.5cm寬的皮條，先用2.5g/L的洗必泰溶液浸泡10min(溶液漫過(guò)皮條)，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液震蕩洗滌三次；3.除去步驟2所得到頭皮的表皮，破碎，在37℃下以100rpm速度攪拌并加入0.5％膠原酶I(溶液漫過(guò)皮條)，攪拌2小時(shí)后懸液過(guò)800目篩，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液過(guò)濾、洗滌截留于篩網(wǎng)上的毛干，收集后在25℃下加入0.075％的胰酶(溶液漫過(guò)組織)靜置20分鐘；4.在K-SFM培養(yǎng)基加入胎牛血清、胰島素、氫化可的松和慶大霉素，使每毫升K-SFM培養(yǎng)基里含有0.1ml胎牛血清、6ug胰島素、0.5ug氫化可的松和40ug慶大霉素；5.將4步驟所得的培養(yǎng)基加入3步驟所得的溶液中，以1000rmp速度離心3次，每次離心5分鐘，倒掉上清液，得到上皮細(xì)胞群；6.在35mm的培養(yǎng)皿中預(yù)鋪濃度為1％的I型膠原，再將步驟5所得到的上皮細(xì)胞群接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
實(shí)施例三
1.重復(fù)實(shí)施例一的步驟1，取1.5×4cm大小的頭皮；2.人頭皮的處理去除頭皮外毛發(fā)以及皮下組織中的脂肪和結(jié)締組織，制成0.3-0.5cm寬的皮條，先用2.5g/L的洗必泰溶液浸泡12min(溶液漫過(guò)皮條)，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液震蕩洗滌三次；3.酶消化法消化除去步驟2所得到頭皮的表皮，破碎，在37℃下以100rpm速度攪拌并加入0.5％膠原酶I(溶液漫過(guò)皮條)，攪拌2小時(shí)后懸液過(guò)800目篩，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液過(guò)濾、洗滌截留于篩網(wǎng)上的毛干，收集后在25℃下加入0.075％的胰酶(溶液漫過(guò)組織量)靜置20分鐘；4.培養(yǎng)基的配制在K-SFM培養(yǎng)基加入胎牛血清、胰島素、氫化可的松和慶大霉素，使每毫升K-SFM培養(yǎng)基里含有0.1ml胎牛血清、6ug胰島素、0.5ug氫化可的松和40ug慶大霉素；5.將4步驟所得的培養(yǎng)基加入3步驟所得的溶液中，以1000rmp速度離心3次，每次離心5分鐘，倒掉上清液，得到上皮細(xì)胞群；6.在35mm的培養(yǎng)皿中預(yù)鋪濃度為1％的I型膠原，再將步驟5所得到的上皮細(xì)胞群接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
實(shí)施例四毛囊上皮細(xì)胞的培養(yǎng)取實(shí)施例一、二或三所得到的上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液按公知的方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，加入濃度為0.1％的胰酶1ml，在倒置顯微鏡下控制消化，細(xì)胞皺縮后棄掉胰酶，加入按實(shí)施例一步驟4配制的培養(yǎng)基2ml，吹散細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，分8組，每組3個(gè)孔。培養(yǎng)8天后即可得到大量的構(gòu)建毛囊組織所需的上皮細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種高效快速分離人頭皮毛囊中上皮細(xì)胞的方法，依次包括以下步驟a.人頭皮的處理去除頭皮外毛發(fā)以及皮下組織中的脂肪和結(jié)締組織，制成0.3-0.5cm寬的皮條，先用2.5g/L的洗必泰溶液浸泡10-15min，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液震蕩洗滌三次；b.酶消化法消化除去表皮，破碎，在37℃下以100rpm速度攪拌并加入0.5％膠原酶I，攪拌2小時(shí)后懸液過(guò)800目篩，再用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液過(guò)濾洗滌截留于篩網(wǎng)上的毛干，收集后在25℃下加入0.075％的胰酶靜置20分鐘；c.培養(yǎng)基的配制在K-SFM培養(yǎng)基加入胎牛血清、胰島素、氫化可的松和慶大霉素，使每毫升K-SFM培養(yǎng)基里含有0.1ml胎牛血清、6ug胰島素、0.5ug氫化可的松和40ug慶大霉素；d.將c步驟所得的培養(yǎng)基加入b步驟所得的溶液中，以1000rmp速度離心3次，每次離心5分鐘，倒掉上清液，得到上皮細(xì)胞群；e.在培養(yǎng)器中預(yù)鋪濃度為1％的I型膠原，再將步驟d所得到的上皮細(xì)胞群接種到培養(yǎng)器中培養(yǎng)便得。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種毛囊上皮細(xì)胞的高效快速分離方法，該方法采用兩步消化法消化頭皮，即先用膠原酶I消化，再用胰酶消化，得到上皮細(xì)胞群并進(jìn)行接種、培養(yǎng)。該方法對(duì)整塊頭皮進(jìn)行批量處理，從中分離出毛囊上皮細(xì)胞，具有高效快速的顯著效果。
文檔編號(hào)C12N5/08GKCN1834235SQ200610034482
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2006年3月22日
發(fā)明者胡志奇, 孫錫金 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan