專利名稱:一種dna電化學傳感器及其制備方法
技術領域:
本發(fā)明涉及生物電化學傳感器及其制備領域,特別涉及一種脫氧核糖核酸(DNA)電化學傳感器及其制備方法。
背景技術:
基因診斷是通過直接檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病做出診斷的方法?;蛟\斷的探測目的物是脫氧核糖核酸或核糖核酸(RNA)。在基因診斷的方法學方面,先后建立了限制性內切酶酶譜分析、核酸分子雜交、限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析、聚合酶鏈式反應(PCR),以及近年發(fā)展起來的DNA傳感器及DNA芯片技術等。標記法核酸雜交檢測技術現(xiàn)已廣泛應用于生物學、醫(yī)學和環(huán)境科學等有關領域,但其實驗過程費時,費力,并且傳統(tǒng)的放射性同位素標記安全性差,難以滿足各方面的需要,發(fā)展新型分子雜交快速檢測技術已經迫在眉睫。DNA傳感器為核酸雜交快速檢測提供了一個新途徑,它是以雜交過程高特異性為基礎的快速傳感檢測技術。
自人類基因組破解以來,DNA傳感器領域的發(fā)展日新月異,目前已取得相當大的進展。生物科學、計算機科學、材料、微電子等各學科中多種理論和技術在該領域得到廣泛應用。DNA傳感器及DNA芯片應用于DNA測序、突變檢測、基因篩選、基因診斷以及幾乎所有應用核酸雜交的領域。在眾多DNA傳感檢測方法中,基于分子電學性質的電化學技術具有獨特的優(yōu)越性。電化學檢測技術靈敏、快速、成本非常低廉,而且檢測裝置輕便、低能耗且易于微型化和集成化,符合手持式檢測裝置以及未來的芯片實驗室(lab-on-a-chip)的要求。而且電化學基因傳感技術通常具有以下特點雜交反應在其表面上直接完成,并且轉換器能夠將雜交過程所產生的變化轉變成電信號;根據(jù)雜交前后電信號變化量,從而推斷出被檢DNA的量;具有準確、快速和廉價等優(yōu)越性;更重要的是,其能被推廣應用到所有和DNA序列信息相關的領域中。
目前,有關納米材料的合成和應用方面的研究發(fā)展迅速。納米材料的引入,使DNA傳感器對雜交檢測的靈敏度和選擇性都大為提高。金納米粒子是一種應用廣泛的抗原、抗體和細胞標記物,美國西北大學納米技術研究所Mirkin教授領導的研究組在利用寡核苷酸修飾的金納米粒子進行DNA堿基識別方面進行了開創(chuàng)性研究。通過雜交前后體系顏色的變化來實現(xiàn)對DNA的檢測具有儀器簡單、實驗方便和結果直觀等特點.但由于視覺辨別的局限性,使得色差識別的靈敏度較低,所以這種方法具有一定的局限性。
公開號為CN1215327的專利公開了一種DNA電化學納米傳感器的制備方法,該傳感器將目的DNA(靶向DNA)通過金納米晶固定在金電極上,再使銀納米晶標記的互補DNA發(fā)生雜交反應,在酸性介質中將銀納米晶氧化釋放以離子狀態(tài)存在于溶液中,通過電化學方法檢測銀離子的量從而檢測目標DNA的量。該傳感器檢測靈敏度可達10pmol/L,但只能適用于待測的目的DNA具有巰基基團,或將其在檢測前進行巰基修飾,故實際應用有一定局限性;另外,相對于電化學傳感方法,其檢測靈敏度尚有很大不足,而且尚不能實現(xiàn)SNP檢測。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術的缺陷,提供一種靈敏度及特異性更高的DNA電化學傳感器。
本發(fā)明的電化學傳感器,其包括金電極、與靶向DNA(目的DNA)序列互補的互補DNA、金納米粒子和電化學指示劑,其中一段互補DNA作為捕獲探針組裝于金電極上;而另一段互補DNA作為檢測探針與金納米粒子結合成復合物,作為電化學指示劑的載體。
其中,上述電化學指示劑可為任何現(xiàn)有能通過電化學方法指示DNA雜交反應發(fā)生的物質。本發(fā)明優(yōu)選可與帶負電的DNA磷酸骨架通過靜電力結合的帶正電的過渡金屬離子,特別是釕離子,鈷離子等VIII族過渡金屬離子,其吸附在電極表面的量隨DNA量的增加而增加。
本發(fā)明所用金納米粒子的粒徑太大,則金粒子體積大,連接到電極上的個數(shù)少;太小的金粒子則組裝的DNA數(shù)量少,放大效果不明顯。故本發(fā)明優(yōu)選的金納米粒子的粒徑為10~50納米。
更佳地,為提高雜交效率,該金電極上的捕獲探針的密度最好控制在1.2×1012~1.2×1013mol/cm2之間。
本發(fā)明的另一目的是提供上述DNA電化學傳感器的制備方法。
本發(fā)明的制備方法包括以下步驟①在潔凈的純金電極上組裝巰基修飾的捕獲探針;②將目的DNA和其金納米粒子結合的互補DNA(AuNP-DNA)預雜交后,再與金電極上的捕獲探針雜交;③將步驟②所得金電極置入電解液中,并加入與DNA特異結合的電化學指示劑,用電化學檢測方法檢測金電極表面上吸附的電化學指示劑的電量,通過計算雜交前后電極表面電化學數(shù)值變化指示雜交反應的發(fā)生。
較佳地,所述的步驟①包括在潔凈的純金電極上滴加巰基修飾的捕獲探針溶液,再用巰基化合物,如巰基己醇等巰基醇類化合物進行處理,使捕獲探針直立于金電極表面,有助于提高DNA的雜交效率。更佳地,進一步通過調節(jié)捕獲探針在金電極上的密度來提高雜交效率,該密度最好控制在上述1.2×1012~1.2×1013mol/cm2范圍內。
步驟②的雜交條件同現(xiàn)有技術,例如包括先將目的DNA與金納米粒子結合的互補DNA(檢測探針)混合,25~40℃預雜交30~60分鐘左右,再將修飾了捕獲探針的金電極浸入到預雜交溶液中雜交約0.5~2個小時,特別是一個小時左右,清洗電極除去非特異性吸附到電極表面的金納米粒子及未雜交的目的DNA。
本發(fā)明所說的金納米粒子結合的互補DNA,或稱組裝了互補DNA的金納米粒子,也是利用金納米粒子與帶有巰基功能團的DNA相互作用的特性,可通過將末端巰基修飾的互補DNA與金納米粒子溶液混合制得的復合物。
本發(fā)明中互補DNA(檢測探針DNA或捕獲探針DNA)的巰基修飾可采用任何現(xiàn)有技術或商業(yè)途徑獲得。
而本發(fā)明制備方法步驟③中的電解液可為常規(guī)的緩沖電解液,如pH為7.4的10mM Tris-HCl緩沖液;而所用的電化學檢測方法可為任何現(xiàn)有常規(guī)的電化學檢測方法,如計時電量法或循環(huán)伏安法等,本發(fā)明優(yōu)選計時電量法,因其可定量檢測釕離子的吸附量。
因此,在本發(fā)明一較佳實施例中,本發(fā)明的制備方法包括下列步驟(1)電極表面探針DNA的組裝在潔凈的電極上滴加巰基修飾的寡核苷酸探針溶液(pH7.2~7.8)組裝30~60分鐘,然后再在巰基己醇水溶液中浸泡2~4小時,取出后用MilliQ水沖洗干凈。
(2)雜交先將目的序列DNA與AuNP-DNA溶液混合,25~40℃預雜交30~60分鐘,再將修飾了捕獲DNA的金電極浸入到預雜交溶液中雜交一個小時,雜交反應后用大量Tris-HCl洗液清洗電極,洗去非特異性吸附到電極表面的金納米粒子及未雜交的目的DNA。
(3)電化學檢測在10mM Tris-HCl電解液中加入釕離子(Ru3+)至其飽和作為電化學指示劑,用計時電量法檢測DNA修飾電極表面上吸附的釕離子的電量,定量檢測目的基因的濃度。
本發(fā)明利用金與修飾有巰基基團的DNA間的相互作用,將已知序列的DNA捕獲探針固定在金電極表面,通過DNA分子的雜交,捕獲目的序列DNA,再通過目的DNA的一段序列捕獲修飾在金納米粒子(AuNP)上的另一段DNA(AuNP-DNA),每個金納米粒子上都連接幾十至上百條DNA,從而通過這種“夾心式”的雜交方法,在有靶序列DNA的存在下,AuNP-DNA被連接到電極表面,理論上只要有一條靶序列與捕獲探針雜交,就會將一個組裝了多條DNA(檢測探針)的金納米粒子連接到電極表面,從而使電極表面DNA密度大大增加,即雜交反應使電極表面富含大量帶負電荷的DNA鏈;再通過加入與DNA特異結合的電化學指示劑,即引入帶正電荷的過渡金屬離子作為雜交指示劑,通過檢測雜交前后電極表面過渡金屬離子的電量指示DNA雜交反應的發(fā)生。由于金納米粒子的放大作用,此傳感器在靶序列濃度極低時也有明顯信號,檢測限可達到10fmol·L-1,并有很強的區(qū)分單堿基錯配的能力。而且本發(fā)明中使用的DNA修飾的金電極具有重復使用的特點。
圖1是本發(fā)明一實施例及對比實施例的示意圖。其中,A為在清洗干凈的純金電極上組裝末端巰基修飾的寡核苷酸捕獲探針;B為經過巰基己醇處理,使大部分探針直立于電極表面;C為將靶序列DNA和組裝了一段與靶序列互補的DNA的金納米粒子溶液混合,預雜交一段時間后再與電極上的探針雜交,并加入釕離子;D為將靶序列DNA與電極上的探針直接雜交,并加入釕離子。
圖2顯示通過金電極表面的DNA捕獲探針密度控制來提高靶向DNA的雜交效率。密度控制范圍在1.2×1012~1.2×1013molecule/cm2;其中,A為該密度范圍的捕獲探針與1μM靶向DNA雜交的情況(無AuNP放大),B為采用本發(fā)明在AuNP存在下該密度范圍的捕獲探針與10pM靶向DNA雜交的情況,C為不同密度探針的示意圖。
圖3是各種條件下金電極上捕獲探針在反應液中的循環(huán)伏安法掃描圖,虛線電極上只有捕獲探針;實線捕獲探針與1μM靶DNA雜交(無AuNP放大);粗線本發(fā)明捕獲探針與10pM靶DNA雜交(AuNP放大)。
圖4是各種條件下金電極上捕獲探針在反應液中的計時電量法掃描圖,Q單鏈電極上只有捕獲探針;Q雙鏈捕獲探針與1μM靶DNA雜交(無AuNP放大);Q金膠本發(fā)明的捕獲探針與1pM靶DNA雜交(AuNP放大)。
圖5是采用本發(fā)明的傳感器檢測不同濃度的靶向DNA,A是通過計時電量法測定電極表面與不同濃度靶序列雜交后吸附釕離子的電量,B顯示用此方法測定含有46個堿基的DNA濃度范圍在50fmol·L-1~10pmol·L-1有良好的線性關系,檢測限在10fmol·L-1。
圖6是采用本發(fā)明的DNA電化學傳感器實現(xiàn)DNA的單堿基多態(tài)性(SNP)檢測;A為靶向DNA完全匹配,T、C、G為靶向DNA上存在不同的單堿基錯配。
圖7顯示本發(fā)明中捕獲探針修飾的金電極的再生性能變化(雜交效率變化)情況。通過數(shù)個循環(huán)的高溫變性過程,再生電極的捕獲性能基本不變。
具體實施方式
下面用實施例來進一步說明本發(fā)明,但本發(fā)明并不受其限制。
實施例1如圖1所示A、B、C步驟,制備本發(fā)明的DNA電化學傳感器。
(1)電極預處理及捕獲探針DNA的組裝首先將金電極在磨布上用氧化鋁磨料懸液中打磨后,再分別在乙醇和MilliQ水中超聲清洗,最后用電化學法清洗電極以去除殘留的雜質。氮氣吹干后,在電極上滴加0.2μM巰基修飾的寡核苷酸探針組裝溶液[pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS),其中NaCl濃度為0.1M]在室溫下靜置約60分鐘,然后再在2mM巰基己醇水溶液中浸泡約2小時,取出后用MilliQ水沖洗干凈。
(2)雜交先將目的序列DNA與AuNP-DNA溶液(AuNP直徑為20納米)混合,25℃預雜交60分鐘,再將修飾了捕獲探針DNA的金電極浸入到預雜交溶液中常溫下雜交一個小時,雜交反應后用大量Tris-HCl洗液清洗電極,洗去非特異性吸附到電極表面的金納米粒子及未雜交的目的DNA。
(3)電化學檢測將上述金電極放入10mM Tris-HCl電解液(pH7.4)3ml中,再加入釕離子(Ru3+),使其在電解液中的終濃度為50μM,作為電化學指示劑,用計時電量法檢測DNA修飾電極表面上吸附的釕離子的電量,通過雜交反應,修飾大量DNA的金納米粒子連接到電極表面,同時吸附大量的釕離子到電極表面上,所以雜交后的電量值遠遠大于雜交前,達到放大雜交反應的目的。用此方法測定含有38個堿基的基因序列線性濃度范圍在50fmol·L-1~10pmol·L-1。其中,捕獲探針與1pM靶向DNA雜交的掃描曲線如圖4中的Q金膠所示。
對比實施例1按照圖1的A、B、D步驟,在步驟2中直接將修飾了捕獲探針DNA的金電極浸入到目的DNA溶液中,余同上述實施例1,其中,捕獲探針與1μM靶DNA雜交,用計時電量法測得的掃描曲線如圖4中的Q雙鏈所示。
而作為陰性對照,在步驟2中直接將修飾了捕獲探針DNA的金電極浸入到不含目的DNA的金納米粒子復合物(AuNP-DNA)溶液中,余同上述實施例1,用計時電量法測得的掃描曲線如圖4中的Q單鏈所示。
可見,通過引入金納米粒子,使電極表面DNA的密度大大增加,從而吸附釕離子的量比不加金納米粒子的吸附量大得多。
實施例2(1)金電極表面捕獲探針DNA的組裝在潔凈、干燥的金電極上滴加pH7.4的巰基修飾的捕獲探針PBS溶液,室溫下組裝60分鐘。其中,通過改變組裝液中捕獲探針的濃度分別為0.2,2.0,5.0μM及NaCl的濃度分別為0.1M,1.0M,1.0M,組裝不同密度的DNA修飾電極,分為高(1.2×1013molecule/cm2)、中(6.0×1012molecule/cm2)、低(1.2×1012molecule/cm2)三種密度(如圖2的C所示),然后再在1mM巰基己醇水溶液中浸泡3小時,取出后用MilliQ水沖洗干凈。
(2)雜交將目的序列DNA與AuNP-DNA溶液(AuNP直徑為20納米)混合,37℃預雜交30分鐘,余同實施例1。
(3)電化學檢測同實施例1。
其中,捕獲探針與10pM靶向DNA雜交的結果如圖2的B所示,提示低密度探針下獲得最高的雜交效率和最大的放大信號。
對比實施例2在上述步驟2中直接將修飾了捕獲探針DNA的金電極浸入到目的DNA溶液中,余同上述實施例2。其中,捕獲探針與1μM靶向DNA雜交的結果如圖2的A所示,同樣也提示低密度探針下獲得最高的雜交效率和最大的放大信號。
實施例3捕獲探針溶液的pH7.8,組裝30分鐘,再在1mM巰基己醇水溶液中浸泡4小時;使用10納米直徑的金納米粒子,修飾了捕獲探針DNA的金電極浸入到預雜交溶液中常溫下雜交2小時;電化學指示劑為鈷離子(Co2+),余同實施例1,通過雜交前后電極表面鈷離子的電量的變化指示雜交反應的發(fā)生。用此方法測定含有38個堿基的基因序列線性濃度范圍在0.5pmol·L-1~10pmol·L-1。
實施例4將實施例1中的金納米粒子直徑改為50納米,計時電量法換成循環(huán)伏安法進行檢測,其中捕獲探針與1pM靶向DNA雜交的掃描曲線如圖3中的粗線所示。
同理,將對比實施例1中的金納米粒子直徑改為50納米,計時電量法換成循環(huán)伏安法進行檢測作為對比實施例3,其中捕獲探針與1μM靶DNA雜交的掃描曲線如圖3中的細實線所示。
同樣作為陰性對照的是在步驟2中直接將修飾了捕獲探針DNA的金電極浸入到不含目的DNA的金納米粒子復合物(AuNP-DNA)溶液中,余同上述實施例4,其掃描曲線如圖3中的虛線所示。
可見,用循環(huán)伏安法也與計時電量法的結果一致,顯示通過引入金納米粒子,使電極表面DNA的密度大大增加,從而吸附釕離子的量比不加金納米粒子的吸附量大得多,從而可提高本發(fā)明傳感器的靈敏度。
上述實施例中的AuNP-DNA制備方法如下將互補DNA(終濃度3μM)加入至不同粒徑的金納米粒子原始商品膠體中,室溫下組裝24h,加入100Mm PBS緩沖液(含1M NaCL)至NaCL的終濃度為0.1M,室溫下老化40h,離心,PBS懸浮,離心與懸浮重復3次后,等體積0.3M PBS懸浮備用。
上述實施例中的所用試劑釕離子、鈷離子和金納米粒子為SIGMA產品;其余試劑為常規(guī)市售產品(分析純或化學純);電化學工作站及配件為上海辰華公司產品(型號CHI430B)。
應用實施例1采用實施例2中的本發(fā)明DNA電化學傳感器(低密度捕獲探針),以乳腺癌基因(BRCA1)的一段序列(含有46個堿基,序列為5’-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATAATTCATAC-3’;其捕獲探針序列為5’-HS-C6-GTATGAATTATAATCAAA-3;其檢測探針序列為5’-GAAACCCTATGTATGCTCTTTTTTTTTT-C6-SH-3’)為目的基因進行濃度檢測。結果如圖5所示,用此方法測定含有46個堿基的乳腺癌基因序列的線性濃度范圍在50fmol·L-1~10pmol·L-1,檢測限可達到10fmol·L-1。
應用實施例2用應用實施例1的方法,對應用實施例1中的乳腺癌基因(BRCA1)一段目的DNA完全匹配的序列、以及在目的DNA上存在不同單堿基錯配的3段序列作為待測靶向DNA分別進行SNP檢測(靶向DNA的濃度都在10pM)。結果如圖6所示,其中,A為與靶向DNA完全匹配,T、C、G為靶向DNA上存在不同的單堿基錯配基因(即在DNA序列該位置上,將堿基為A的核苷酸分別改為堿基為T、C和G的核苷酸)??梢姡景l(fā)明的傳感器具有很強的區(qū)分單堿基錯配的能力,特異性高。
應用實施例3將實施例1中步驟1得到的捕獲探針修飾電極與1μM靶向DNA室溫雜交1小時,然后在水中80℃熱變性10分鐘,重復雜交,變性三個循環(huán),探針組裝量及雜交效率基本保持不變,結果如圖7所示,可見通過數(shù)個循環(huán)的高溫變性過程,再生電極的捕獲性能基本不變。
權利要求
1.一種DNA電化學傳感器,其包括金電極、與靶向DNA序列互補的互補DNA、金納米粒子和電化學指示劑,其特征在于其中一段互補DNA作為捕獲探針組裝于金電極上;而另一段互補DNA作為檢測探針與金納米粒子結合成復合物,作為電化學指示劑的載體。
2.如權利要求
1所述的DNA電化學傳感器,其特征在于該電化學指示劑為帶正電荷的VIII族過渡金屬離子。
3.如權利要求
2所述的DNA電化學傳感器,其特征在于所述帶正電荷的VIII族過渡金屬離子為釕離子或鈷離子。
4.如權利要求
1所述的DNA電化學傳感器,其特征在于該金納米粒子的粒徑為10~50納米。
5.如權利要求
1所述的DNA電化學傳感器,其特征在于該金電極上的捕獲探針的密度為1.2×1012~1.2×1013mol/cm2。
6.如權利要求
1~4任一項所述的DNA電化學傳感器的制備方法,其包括以下步驟①在潔凈的純金電極上組裝巰基修飾的捕獲探針;②將目的DNA和其金納米粒子結合的互補DNA預雜交后,再與金電極上的捕獲探針雜交;③將步驟②所得金電極置入電解液中,并加入與DNA特異結合的電化學指示劑,用電化學檢測方法檢測金電極表面上吸附的電化學指示劑的電量,通過計算雜交前后電極表面電化學數(shù)值變化指示雜交反應的發(fā)生。
7.如權利要求
6所述的制備方法,其特征在于所述的步驟①包括在潔凈的純金電極上滴加巰基修飾的捕獲探針溶液,再用巰基化合物進行處理,使捕獲探針直立于金電極表面。
8.如權利要求
7所述的制備方法,其特征在于所述的巰基化合物為巰基己醇。
9.如權利要求
8所述的制備方法,其特征在于所述捕獲探針在金電極上的密度被控制在1.2×1012~1.2×1013mol/cm2范圍。
10.如權利要求
6所述的制備方法,其特征在于所述的步驟②包括先將目的DNA與組裝了互補DNA的金納米粒子混合,25~40℃預雜交30~60分鐘,再將修飾了捕獲探針的金電極浸入到預雜交溶液中雜交30分鐘~2小時,清洗電極除去非特異性吸附到電極表面的金納米粒子及未雜交的目的DNA。
11.如權利要求
10所述的制備方法,其特征在于所述的組裝了互補DNA的金納米粒子可通過將末端巰基修飾的互補DNA與金納米粒子溶液混合制得。
12.如權利要求
6所述的制備方法,其特征在于步驟③中的電解液為pH為7.4的10mM Tris-HCl緩沖液,所用的電化學檢測方法為計時電量法或循環(huán)伏安法。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種DNA電化學傳感器,其包括金電極、與目的DNA序列互補的互補DNA、金納米粒子和電化學指示劑,其特征在于其中一段互補DNA作為捕獲探針組裝于金電極上,而另一段互補DNA作為檢測探針與金納米粒子結合作為電化學指示劑的載體。本發(fā)明還公開了其制備方法。本發(fā)明通過“夾心式”的雜交方法,使電極表面富含大量帶負電荷的DNA鏈,引入與DNA特異結合的帶正電荷的VIII族過渡金屬離子作為電化學指示劑,通過檢測雜交前后電極表面電化學數(shù)值(電量或電流等)變化指示DNA雜交反應的發(fā)生。由于金納米粒子的放大作用,此傳感器可以檢測痕量目的DNA分子且選擇性高。而且DNA修飾的金電極具有重復使用的特點。
文檔編號C12Q1/68GKCN101078026SQ200610026823
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月24日
發(fā)明者樊春海, 張炯, 宋世平 申請人:江蘇吳中高新技術實業(yè)有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan