本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及提高玉米赤霉烯酮水解酶的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性的方法及t217c-g242c系列突變體、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)是谷物和農(nóng)作物中常見的一種具有類雌激素樣作用的非甾體類霉菌毒素，又被稱為f-2毒素，主要由禾谷鐮刀菌(fusariumgraminearum)、黃色鐮刀菌(fusarum?culmorum)和克地鐮刀菌(fusarum?crookwellense)等真菌產(chǎn)生，在生產(chǎn)實踐中對畜牧業(yè)造成嚴重的危害。

2、微生物降解zen是通過微生物代謝所產(chǎn)生的一種或多種酶協(xié)作對毒素進行降解，條件溫和，特異性強，不破壞原有營養(yǎng)成分且效率高，是一種環(huán)保、高效、實用性強的處理方法。但目前所發(fā)現(xiàn)的赤霉烯酮水解酶活性均較低，阻礙了赤霉烯酮水解酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性提高的玉米赤霉烯酮水解酶突變體。

2、本發(fā)明的再一目的是提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突變體的編碼基因。

3、本發(fā)明的再一目的是提供包含上述玉米赤霉烯酮水解酶突變體編碼基因的重組載體。

4、本發(fā)明的再一目的是提供包含上述玉米赤霉烯酮水解酶突變體編碼基因的重組菌株。

5、本發(fā)明的再一目的是提供一種制備熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性提高的玉米赤霉烯酮水解酶的方法。

6、本發(fā)明的再一目的是提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突變體的應(yīng)用。

7、本發(fā)明對玉米赤霉烯酮水解酶zhdm2進行突變，得到熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性提高的玉米赤霉烯酮水解酶突變體，其中，母本玉米赤霉烯酮水解酶zhdm2的氨基酸序列如seq?idno:1所示：

8、msttratktvttkdgikwhveqegngpdivlvpdglgecqmfdkpmsiiaasgfrvttfdmpgmsrsrdappetyrdvtghklagyvdtlleelkipiasvwgcssgattvlalcaafpervrnamphelptvnpasvtgmeekdpavisqemaavsrsysggteawdalgpevharlhdnyvrwargypvtippsaptksevlhkrpvdwtvgggtptamffdniviavkeglnigllpgghfpyvshpeafaeyvvetcrkyi。

9、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，將玉米赤霉烯酮水解酶zhdm2的第217位和第242位氨基酸由蘇氨酸和甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬玫酵蛔凅wt217c-g242c或者第76位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝滨０返玫酵蛔凅wr76q。

10、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，將玉米赤霉烯酮水解酶zhdm2的第217位、第242位和第76位氨基酸由蘇氨酸、甘氨酸和精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?、半胱氨酸和谷氨酰胺得到突變體t217c-g242c/r76q。

11、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述玉米赤霉烯酮水解酶突變體t217c-g242c的氨基酸序列seq?id?no:2所示：

12、msttratktvttkdgikwhveqegngpdivlvpdglgecqmfdkpmsiiaasgfrvttfdmpgmsrsrdappetyrdvtghklagyvdtlleelkipiasvwgcssgattvlalcaafpervrnamphelptvnpasvtgmeekdpavisqemaavsrsysggteawdalgpevharlhdnyvrwargypvtippsaptksevlhkrpvdwtvgggcptamffdniviavkeglnigllpgchfpyvshpeafaeyvvetcrkyi。

13、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述玉米赤霉烯酮水解酶突變體r76q的氨基酸序列seq?id?no:3所示：

14、msttratktvttkdgikwhveqegngpdivlvpdglgecqmfdkpmsiiaasgfrvttfdmpgmsrsrdappetyqdvtghklagyvdtlleelkipiasvwgcssgattvlalcaafpervrnamphelptvnpasvtgmeekdpavisqemaavsrsysggteawdalgpevharlhdnyvrwargypvtippsaptksevlhkrpvdwtvgggtptamffdniviavkeglnigllpgghfpyvshpeafaeyvvetcrkyi。

15、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述玉米赤霉烯酮水解酶突變體t217c-g242c/r76q的氨基酸序列seq?id?no:4所示：

16、msttratktvttkdgikwhveqegngpdivlvpdglgecqmfdkpmsiiaasgfrvttfdmpgmsrsrdappetyqdvtghklagyvdtlleelkipiasvwgcssgattvlalcaafpervrnamphelptvnpasvtgmeekdpavisqemaavsrsysggteawdalgpevharlhdnyvrwargypvtippsaptksevlhkrpvdwtvgggcptamffdniviavkeglnigllpgchfpyvshpeafaeyvvetcrkyi。

17、本發(fā)明提供了編碼上述玉米赤霉烯酮水解酶zhdm2的基因。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，玉米赤霉烯酮水解酶zhdm2的基因序列如seq?id?no：5所示：

18、atgtccaccaccagagccaccaagactgttaccaccaaggatggaattaagtggcatgttgagcaagaaggaaacggtccagacattgtgttggttccagatggtttgggtgagtgtcaaatgtttgataagcccatgtccattattgcagcctccggttttagagtcactacctttgatatgccaggtatgagtagatccagagatgctcctccagaaacttacagagatgttaccggtcataagctggctggttacgttgacactttgcttgaggaattgaagattccaattgcttctgtttggggttgttcctctggtgctactactgttctggccttgtgtgctgcttttccagaaagagttagaaatgccatgccacacgagttgccaactgttaacccagcttctgttactggtatggaggagaaggaccctgctgttatttctcaagaaatggctgctgtttcaagatcatatagtggtggtactgaagcctgggatgctttaggaccagaagttcatgctagacttcatgataattacgttagatgggctagaggttacccagtgactattccaccatctgccccaaccaagtctgaggttttgcataagagaccagttgattggacagttggtggtggtaccccaactgctatgttttttgataatattgtcatcgctgtcaaggaaggtttgaacattggtttgttgccaggtggtcatttcccatacgtttctcatcctgaagcttttgctgaatacgttgttgagacttgtagaaagtacatttaa。

19、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，玉米赤霉烯酮水解酶突變體t217c-g242c的編碼基因序列如seq?id?no:6所示：

20、atgtccaccaccagagccaccaagactgttaccaccaaggatggaattaagtggcatgttgagcaagaaggaaacggtccagacattgtgttggttccagatggtttgggtgagtgtcaaatgtttgataagcccatgtccattattgcagcctccggttttagagtcactacctttgatatgccaggtatgagtagatccagagatgctcctccagaaacttacagagatgttaccggtcataagctggctggttacgttgacactttgcttgaggaattgaagattccaattgcttctgtttggggttgttcctctggtgctactactgttctggccttgtgtgctgcttttccagaaagagttagaaatgccatgccacacgagttgccaactgttaacccagcttctgttactggtatggaggagaaggaccctgctgttatttctcaagaaatggctgctgtttcaagatcatatagtggtggtactgaagcctgggatgctttaggaccagaagttcatgctagacttcatgataattacgttagatgggctagaggttacccagtgactattccaccatctgccccaaccaagtctgaggttttgcataagagaccagttgattggacagttggtggtggttgtccaactgctatgttttttgataatattgtcatcgctgtcaaggaaggtttgaacattggtttgttgccaggttgtcatttcccatacgtttctcatcctgaagcttttgctgaatacgttgttgagacttgtagaaagtacatt。

21、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，玉米赤霉烯酮水解酶突變體r76q的編碼基因序列如seq?id?no:7所示：

22、atgtccaccaccagagccaccaagactgttaccaccaaggatggaattaagtggcatgttgagcaagaaggaaacggtccagacattgtgttggttccagatggtttgggtgagtgtcaaatgtttgataagcccatgtccattattgcagcctccggttttagagtcactacctttgatatgccaggtatgagtagatccagagatgctcctccagaaacttaccaggatgttaccggtcataagctggctggttacgttgacactttgcttgaggaattgaagattccaattgcttctgtttggggttgttcctctggtgctactactgttctggccttgtgtgctgcttttccagaaagagttagaaatgccatgccacacgagttgccaactgttaacccagcttctgttactggtatggaggagaaggaccctgctgttatttctcaagaaatggctgctgtttcaagatcatatagtggtggtactgaagcctgggatgctttaggaccagaagttcatgctagacttcatgataattacgttagatgggctagaggttacccagtgactattccaccatctgccccaaccaagtctgaggttttgcataagagaccagttgattggacagttggtggtggtaccccaactgctatgttttttgataatattgtcatcgctgtcaaggaaggtttgaacattggtttgttgccaggtggtcatttcccatacgtttctcatcctgaagcttttgctgaatacgttgttgagacttgtagaaagtacatt。

23、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，玉米赤霉烯酮水解酶突變體t217c-g242c/r76q的編碼基因序列如seq?id?no:8所示：

24、atgtccaccaccagagccaccaagactgttaccaccaaggatggaattaagtggcatgttgagcaagaaggaaacggtccagacattgtgttggttccagatggtttgggtgagtgtcaaatgtttgataagcccatgtccattattgcagcctccggttttagagtcactacctttgatatgccaggtatgagtagatccagagatgctcctccagaaacttaccaggatgttaccggtcataagctggctggttacgttgacactttgcttgaggaattgaagattccaattgcttctgtttggggttgttcctctggtgctactactgttctggccttgtgtgctgcttttccagaaagagttagaaatgccatgccacacgagttgccaactgttaacccagcttctgttactggtatggaggagaaggaccctgctgttatttctcaagaaatggctgctgtttcaagatcatatagtggtggtactgaagcctgggatgctttaggaccagaagttcatgctagacttcatgataattacgttagatgggctagaggttacccagtgactattccaccatctgccccaaccaagtctgaggttttgcataagagaccagttgattggacagttggtggtggttgtccaactgctatgttttttgataatattgtcatcgctgtcaaggaaggtttgaacattggtttgttgccaggttgtcatttcccatacgtttctcatcctgaagcttttgctgaatacgttgttgagacttgtagaaagtacatt。

25、根據(jù)本發(fā)明的提高玉米赤霉烯酮水解酶的熱穩(wěn)定性和酸熱穩(wěn)定性的方法包括以下步驟：

26、將玉米赤霉烯酮水解酶zhdm2進行雙點突變，將第217位和第242位氨基酸由蘇氨酸和甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔?/p>

27、將玉米赤霉烯酮水解酶zhdm2進行單點突變，將第76位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝滨０贰?/p>

28、本發(fā)明提供了包含上述玉米赤霉烯酮水解酶突變體的編碼基因的重組載體。優(yōu)選的，所述重組表達載體的出發(fā)載體具體為ppicz(α)a。

29、本發(fā)明還提供了包含上述玉米赤霉烯酮水解酶突變體的編碼基因的重組菌株。優(yōu)選的，所述重組菌的出發(fā)菌株具體為gs115 (ppicz(α)a -zhdm2)。

30、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，制備熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性提高的玉米赤霉烯酮水解酶的方法如下所述：

31、(1)用含有玉米赤霉烯酮水解酶突變體的編碼基因的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到重組菌株；

32、(2)培養(yǎng)重組菌株，誘導玉米赤霉烯酮水解酶表達；

33、(3)回收并純化所表達的玉米赤霉烯酮水解酶。

34、本發(fā)明的有益效果：

35、本發(fā)明通過在玉米赤霉烯酮水解酶的結(jié)構(gòu)中引入一個二硫鍵和一個谷氨酰胺來達到提高熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性的目的。zhdm2在50?℃下處理5?min和10?min之后，剩余活性為26.96%和24.77%；突變體t217c-g242c、r76q和t217c-g242c/r76q在50?℃下處理5?min和10?min之后，剩余酶活分別為68.75%和33.13%、74.09%和57.51%、82.95%和62.69%，分別較zhdm2提高了155.01%和33.75%、174.81%和132.18%、207.68%和153.09%。zhdm2在55?℃下處理2?min和5?min之后，剩余活性為23.53%和7.13%；突變體t217c-g242c、r76q和t217c-g242c/r76q在55?℃下處理2?min和5?min之后，剩余酶活分別為68.53%和13.78%、83.78%和66.05%、83.91%和70.92%，分別較zhdm2提高了191.25%和93.27%、256.06%和826.37%、256.61%和894.67%。在ph?5.0和37?℃處理60?min后，突變體t217c-g242c保留酶活力約為96.41%，突變體r76q保留酶活力約為5.13%，突變體t217c-g242c/r76q保留酶活力約為75.00%，與zhdm2（2.96%）相比分別提高了3157.09%，73.31?%和2433.78%。zhdm2的 tm值為51.54?℃，r76q的 tm值為52.49?℃，t217c-g242c的 tm值為59.82?℃，t217c-g242/r76q的 tm值為60.12?℃，與zhdm2相比分別提高了0.95?℃，8.28?℃，8.58?℃。因此，本發(fā)明提供的玉米赤霉烯酮水解酶突變體可以很好的應(yīng)用于食品和飼料行業(yè)中，有廣闊的應(yīng)用前景。