本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種噬菌體裂解酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、自青霉素問世以來，已經(jīng)開發(fā)出許多抗菌藥物并廣泛用于對(duì)抗病原體的感染，但目前已經(jīng)有很多細(xì)菌對(duì)這些藥物產(chǎn)生了耐藥性?？股貙?duì)致病菌的療效下降，使得人們迫切需要尋找潛在的替代抗生素（tacconelli?et?al.?2018）?？股啬退幮允侨蚬残l(wèi)生的主要威脅。不幸的是，耐藥病原體的出現(xiàn)正在迅速增長，世界正在走向后抗生素時(shí)代。鮑曼不動(dòng)桿菌是臨床上最重要的病原體之一，對(duì)耐藥分離株的治療已經(jīng)造成了嚴(yán)重的問題。鮑曼不動(dòng)桿菌是一種革蘭陰性菌，可引起一系列感染，包括傷口、皮膚和尿路感染、肺炎和菌血癥（v.?manchanda?et?al,?2019）。在2024年世界衛(wèi)生組織（who）發(fā)布的耐抗生素細(xì)菌優(yōu)先病原體清單中，已經(jīng)將碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌列為了關(guān)鍵優(yōu)先級(jí)之首。

2、噬菌體裂解酶是一種來自于噬菌體的抗菌蛋白，它在噬菌體侵染宿主細(xì)胞的后期被釋放出來，可以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖層從而達(dá)到裂解細(xì)菌的目的。根據(jù)其作用于細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層中不同的化學(xué)鍵，可以將其分為內(nèi)肽酶、酰胺酶和糖苷酶等。噬菌體裂解酶經(jīng)常表現(xiàn)出模塊化結(jié)構(gòu)，通常由一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。然而，在革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁外層，由一層細(xì)胞壁外膜覆蓋著肽聚糖層，這使得它們比革蘭氏陽性菌更能抵抗噬菌體裂解酶的作用（vermassen?et?al.?2019）。

3、lysecp26是來自于大腸桿菌噬菌體中的一種噬菌體裂解酶（dowon?park，2020）。在之前的研究中，中國專利cn117625658a公開了一種噬菌體裂解酶重組蛋白en6-1，其在lysecp26裂解酶的c端添加了一段細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域sp10（重命名為en6-1），提高了其對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的活性，但重組蛋白en6-1對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌效果有限，重組蛋白en6-1對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的體外最低抑菌濃度為3.9?μg/ml，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中鮑曼不動(dòng)桿菌的高效殺滅。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，進(jìn)一步提高噬菌體裂解酶的比活力和降低噬菌體裂解酶對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌濃度，本發(fā)明的目的是提供一種酶活提高的、對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌殺菌活性更強(qiáng)的噬菌體裂解酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明選擇了en6-1蛋白中第9位，第63位，第90位，第130位氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變，經(jīng)過篩選，獲得了一種酶活提高的噬菌體裂解酶突變體18#，其對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的殺菌活性優(yōu)于en6-1蛋白。

2、本發(fā)明的目的至少通過如下技術(shù)方案之一實(shí)現(xiàn)。

3、本發(fā)明的第一方面提供一種噬菌體裂解酶突變體，所述噬菌體裂解酶突變體包含如下特征中一種：

4、1）如seq?id?no：6所示氨基酸序列的蛋白；

5、2）與seq?id?no：6具有90%及以上的序列一致性，且第9位、第63位、第90位和第130位氨基酸序列與seq?id?no：6相同的蛋白。

6、進(jìn)一步的，2）中的蛋白具體指，如seq?id?no：6所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的，或者在n-末端和/或c-末端添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如seq?id?no：6所示蛋白的功能的蛋白，所述2）中的氨基酸序列可與seq?id?no：6具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列一致性。所述第9位、第63位、第90位和第130位氨基酸序列為4個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)在蛋白中的相對(duì)位置。例如，當(dāng)在n-末端添加一個(gè)氨基酸，則所述第9位、第63位、第90位和第130位氨基酸序列對(duì)應(yīng)調(diào)整為第10位、第64位、第91位和第131位氨基酸序列。

7、在本發(fā)明中，如seq?id?no：6所示氨基酸序列的蛋白命名為噬菌體裂解酶突變體18#。

8、本發(fā)明的第二方面是提供一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼前述噬菌體裂解酶突變體。

9、進(jìn)一步的，所述多核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no：5所示的核酸片段；或，所述多核苷酸與seq?id?no：5具有90％及以上的序列一致性，且所述多核苷酸包含第25-27位、第187-189位、第268-270位和第388-390位與seq?id?no：5相同的核酸片段。

10、本發(fā)明的第三方面是一種引物對(duì)，所述引物對(duì)用于擴(kuò)增前述多核苷酸。

11、進(jìn)一步的，所述引物對(duì)的上游引物的核苷酸序列如seq?id?no：3所示，所述引物對(duì)的下游引物的核苷酸序列如seq?id?no：4所示。

12、本發(fā)明的第四方面是提供一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含前述多核苷酸和骨架質(zhì)粒。

13、進(jìn)一步的，所述骨架質(zhì)粒為pet28a（+）。

14、本發(fā)明的第五方面是提供一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含前述核酸構(gòu)建體或前述多核苷酸。

15、進(jìn)一步的，所述細(xì)胞選自大腸桿菌。

16、更進(jìn)一步的，所述細(xì)胞選自大腸桿菌dh5α菌株或大腸桿菌bl21菌株。

17、本發(fā)明的第六方面是提供前述的噬菌體裂解酶突變體的制備方法，包括以下步驟：（i）培養(yǎng)前述的細(xì)胞；（ii）收集含有所述噬菌體裂解酶突變體的培養(yǎng)物；（iii）從培養(yǎng)物中分離出所述噬菌體裂解酶突變體。

18、本發(fā)明的第七方面是提供前述噬菌體裂解酶突變體在制備抗鮑曼不動(dòng)桿菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述產(chǎn)品包括抑菌劑、藥物、消毒劑或清潔劑。

19、本發(fā)明的第八方面是提供一種抑菌劑或藥物，所述抑菌劑或藥物的活性成分包含前述噬菌體裂解酶突變體。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

21、本發(fā)明針對(duì)en6-1蛋白構(gòu)建了大量的點(diǎn)突變，構(gòu)建出了en6-1氨基酸序列中第9位，第63位，第90位，第130位氨基酸的隨機(jī)飽和突變文庫，制備出了一系列帶有點(diǎn)突變位點(diǎn)的en6-1蛋白突變體，從中篩選得到了酶活提高的、對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌殺菌活性更強(qiáng)的噬菌體裂解酶突變體，對(duì)于其他蛋白的分子改造提供了參考。

22、本發(fā)明篩選得到的噬菌體裂解酶突變體18#的比活力，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌殺菌活性顯著高于en6-1蛋白。如本發(fā)明實(shí)施例所示，在相同的蛋白濃度下，噬菌體裂解酶突變體18#對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的殺菌率為99.5%，而en6-1蛋白對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的殺菌率僅為60.4%；噬菌體裂解酶突變體18#對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的體外最小抑菌濃度為2.0?μg/ml，而en6-1蛋白樣品對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的體外最小抑菌濃度為4.0?μg/ml。

技術(shù)特征：

1.一種噬菌體裂解酶突變體，其特征在于，所述噬菌體裂解酶突變體包含如下特征中一種：

2.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的噬菌體裂解酶突變體；

3.一種引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)用于擴(kuò)增權(quán)利要求2所述的多核苷酸；所述引物對(duì)的上游引物的核苷酸序列如seq?id?no：3所示，所述引物對(duì)的下游引物的核苷酸序列如seq?id?no：4所示。

4.一種核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述核酸構(gòu)建體包含權(quán)利要求2所述的多核苷酸和骨架質(zhì)粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述骨架質(zhì)粒為pet28a（+）。

6.一種細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求2所述的多核苷酸或權(quán)利要求4-5任一所述的核酸構(gòu)建體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞選自大腸桿菌，其中包含權(quán)利要求2所述的多核苷酸或權(quán)利要求4-5任一所述的核酸構(gòu)建體。

8.權(quán)利要求1所述的噬菌體裂解酶突變體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（i）培養(yǎng)權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)所述的細(xì)胞；（ii）收集含有所述噬菌體裂解酶突變體的培養(yǎng)物；（iii）從培養(yǎng)物中分離出所述噬菌體裂解酶突變體。

9.權(quán)利要求1所述的噬菌體裂解酶突變體在制備抗鮑曼不動(dòng)桿菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括抑菌劑、藥物、消毒劑或清潔劑。

10.一種抑菌劑或藥物，其特征在于，所述抑菌劑或藥物的活性成分包含權(quán)利要求1所述的噬菌體裂解酶突變體。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種噬菌體裂解酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)En6?1蛋白構(gòu)建了大量的點(diǎn)突變，并從中篩選得到了酶活提高的、對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌殺菌活性更強(qiáng)的噬菌體裂解酶突變體18#，噬菌體裂解酶突變體18#對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的體外最小抑菌濃度為2.0μg/mL，可實(shí)現(xiàn)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的高效殺滅。

技術(shù)研發(fā)人員：曹海生,吳宏宇,蔣港,李國棟,黃晉江,陸婉英
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海高科生物工程有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6