本發(fā)明涉及酶活性檢測領(lǐng)域，特別涉及一種重組酶結(jié)合探針致熒光信號下降在酶活性檢測方面的應(yīng)用及檢測方法。

背景技術(shù)：

1、重組酶在基因重組、dna（脫氧核糖核酸）修復(fù)和復(fù)制中扮演重要角色，發(fā)揮功能時需要與單鏈結(jié)合蛋白等互作配合，常見的重組酶種類包括reca、uvsx、rad51等（行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語，無正式中文名），此類酶在等溫擴(kuò)增體系中發(fā)揮重要功能。等溫擴(kuò)增體系往往在較低溫度下進(jìn)行，等溫擴(kuò)增體系內(nèi)的dna以穩(wěn)定雙鏈狀態(tài)存在，當(dāng)引物探針與靶標(biāo)同源區(qū)實(shí)現(xiàn)退火時，無法像pcr（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增體系一樣，隨機(jī)碰撞實(shí)現(xiàn)，只能依賴于生物功能酶綁定引物探針并在模板同源區(qū)實(shí)現(xiàn)重組。

2、重組酶的分子功能包括atp（腺嘌呤核苷三磷酸）結(jié)合、atp依賴的dna損傷傳感器活性、單鏈dna結(jié)合活性、雙鏈dna結(jié)合活性等，以t4噬菌體?uvsx為例，該酶可以先綁定dna單鏈，與雙鏈同源區(qū)結(jié)合，此時發(fā)揮雙鏈dna結(jié)合活性，此外，uvsx與單鏈dna結(jié)合后可以發(fā)揮atp酶的功能，使atp降解。重組酶的功能多樣，在等溫技術(shù)分子診斷中發(fā)揮重要作用，目前已公布的酶活檢測方法中，大部分只能在進(jìn)行定性分析，如中國專利cn107893103a，部分可進(jìn)行定量分析，如中國專利cn108118085a，但該檢測方法操作復(fù)雜，成本高（涉及生物素標(biāo)記、以及磁珠等），最終定量結(jié)果還要依賴電泳等檢測手段，時間長，不易推廣，且電泳結(jié)果進(jìn)行定量分析精度不夠，重復(fù)性受多方面因素影響，因此考慮開發(fā)一種操作簡便、定量準(zhǔn)確的重組酶檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對上述存在的問題，提供一種重組酶結(jié)合探針致熒光信號下降在酶活性檢測方面的應(yīng)用及檢測方法，該應(yīng)用獲得的檢測方法操作簡便，成本低，檢測時間短，僅10分鐘即可完成定量檢測，多次實(shí)驗重復(fù)結(jié)果一致性強(qiáng)，便于推廣，克服了現(xiàn)有檢測方法所存在的不足。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種利用重組酶結(jié)合探針后會導(dǎo)致探針熒光信號下降的特性，在定量檢測重組酶活性方面的應(yīng)用。

3、進(jìn)一步，所述重組酶為未經(jīng)淬滅劑修飾的重組酶。

4、進(jìn)一步，所述重組酶為所述重組酶為reca、uvsx、rad51中的一種或多種組合，優(yōu)選為uvsx酶。

5、進(jìn)一步，所述探針為一條。

6、進(jìn)一步，所述探針僅帶有一個發(fā)光基團(tuán)。

7、進(jìn)一步，利用重組酶結(jié)合探針后，探針熒光信號的下降量來定量計算重組酶的活性。

8、進(jìn)一步，在定量檢測過程中，根據(jù)探針過量或重組酶過量的不同情況，賦予重組酶不同的酶活性定義，并計算得到在該定義下的酶活性定量檢測結(jié)果。

9、進(jìn)一步，當(dāng)探針過量時，重組酶的酶活性定義為：與1pmol僅在5’端存在一個發(fā)光基團(tuán)的探針飽和結(jié)合，并使其熒光信號下降所需要的重組酶酶量為1u；當(dāng)重組酶過量時，重組酶的酶活性定義為：飽和結(jié)合一條僅在5’端存在一個發(fā)光基團(tuán)的探針導(dǎo)致熒光信號下降x%，視為比活為10x?u/mg，其中，10為自定義常數(shù)。

10、進(jìn)一步，本發(fā)明還包括一種重組酶活性定量檢測方法，包括如下步驟：

11、a、設(shè)計一條僅帶有一個發(fā)光基團(tuán)的探針，以使待測重組酶與其結(jié)合并導(dǎo)致其熒光信號下降；

12、b、以不同梯度重組酶濃度為橫坐標(biāo)，以各濃度重組酶與定量探針結(jié)合后的熒光下降量為縱坐標(biāo)，建立重組酶濃度與熒光下降量的線性回歸曲線；

13、c、配置探針反應(yīng)體系，建立探針與熒光高度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線1，在探針體系內(nèi)加入重組酶，建立探針與重組酶飽和結(jié)合探針后熒光高度的標(biāo)準(zhǔn)曲線2，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1和標(biāo)準(zhǔn)曲線2的熒光高度差為縱坐標(biāo)，以不同探針摩爾量為橫坐標(biāo)，建立不同濃度探針與熒光下降量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

14、d、根據(jù)探針過量或重組酶過量的不同情況，賦予重組酶不同的酶活性定義，并計算得到在該定義下的酶活性定量檢測結(jié)果。

15、進(jìn)一步，當(dāng)探針過量時，重組酶的酶活性定義為：與1pmol僅在5’端存在一個發(fā)光基團(tuán)的探針飽和結(jié)合，并使其熒光信號下降所需要的重組酶酶量為1u；在計算酶活性時，將探針量代入不同濃度探針與熒光下降量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將計算得到的熒光下降量代入線性回歸曲線，計算得到酶活性定量數(shù)據(jù)。

16、進(jìn)一步，當(dāng)重組酶過量時，重組酶的酶活性定義為：飽和結(jié)合一條僅在5’端存在一個發(fā)光基團(tuán)的探針導(dǎo)致熒光信號下降x%，視為比活為10x?u/mg，其中，10為自定義常數(shù)；在計算酶活性時，計算不同濃度探針與熒光下降量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k1，k/k1的比值即為x值，將蛋白濃度換算為質(zhì)量，1μl蛋白原液對應(yīng)酶活為x×1μl?/106。

17、進(jìn)一步，重組酶的濃度為0ng/μl-500ng/μl。

18、進(jìn)一步，在步驟b中，定量探針的量為10pmol。

19、進(jìn)一步，所述探針反應(yīng)體系包括：探針、反應(yīng)緩沖液以及h2o，所述反應(yīng)緩沖液包括tris-hcl（tris鹽酸鹽，一種緩沖鹽）、醋酸鉀、醋酸鎂、dtt（二硫蘇糖醇）。

20、綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

21、1、本發(fā)明以重組酶與探針結(jié)合，會使得探針熒光信號下降為原理，建立了重組酶結(jié)合探針時與熒光信號下降的關(guān)系，從而對重組酶的活性進(jìn)行定量檢測，且所述重組酶未經(jīng)淬滅劑修飾，定量準(zhǔn)確。

22、2、本發(fā)明的檢測方法相對于現(xiàn)有的其它檢測方法，具有操作簡單、定量準(zhǔn)確、可推廣使用的優(yōu)點(diǎn)，同時相比濃度單位更加準(zhǔn)確。

技術(shù)特征：

1.一種利用重組酶結(jié)合探針后會導(dǎo)致探針熒光信號下降的特性，在定量檢測重組酶活性方面的應(yīng)用，其特征在于，所述重組酶為未經(jīng)淬滅劑修飾的重組酶，所述探針為一條，且所述探針僅帶有一個發(fā)光基團(tuán)。

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組酶為包含reca、uvsx、rad51中的一種或多種組合。

3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，利用重組酶結(jié)合探針后，探針熒光信號的下降量來定量計算重組酶的活性。

4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，在定量檢測過程中，根據(jù)探針過量或重組酶過量的不同情況，賦予重組酶不同的酶活性定義，并計算得到在該定義下的酶活性定量檢測結(jié)果。

5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)探針過量時，重組酶的酶活性定義為：與1pmol僅在5’端存在一個發(fā)光基團(tuán)的探針飽和結(jié)合，并使其熒光信號下降所需要的重組酶酶量為1u；當(dāng)重組酶過量時，重組酶的酶活性定義為：飽和結(jié)合一條僅在5’端存在一個發(fā)光基團(tuán)的探針導(dǎo)致熒光信號下降x%，視為比活為10x?u/mg，其中，10為自定義常數(shù)。

6.一種重組酶活性定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

7.如權(quán)利要求6所述的重組酶活性定量檢測方法，其特征在于，當(dāng)探針過量時，重組酶的酶活性定義為：與1pmol僅在5’端存在一個發(fā)光基團(tuán)的探針飽和結(jié)合，并使其熒光信號下降所需要的重組酶酶量為1u；在計算酶活性時，將探針量代入不同濃度探針與熒光下降量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將計算得到的熒光下降量代入線性回歸曲線，計算得到酶活性定量數(shù)據(jù)。

8.如權(quán)利要求6所述的重組酶活性定量檢測方法，其特征在于，當(dāng)重組酶過量時，重組酶的酶活性定義為：飽和結(jié)合一條僅在5’端存在一個發(fā)光基團(tuán)的探針導(dǎo)致熒光信號下降x%，視為比活為10x?u/mg，其中，10為自定義常數(shù)；在計算酶活性時，計算不同濃度探針與熒光下降量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k1，k/k1的比值即為x值，將蛋白濃度換算為質(zhì)量，1μl蛋白原液對應(yīng)酶活為x×1μl?/106。

9.如權(quán)利要求6所述的重組酶活性定量檢測方法，其特征在于，重組酶的濃度為0ng/μl-500ng/μl。

10.如權(quán)利要求6所述的重組酶活性定量檢測方法，其特征在于，在步驟b中，定量探針的量為10pmol。

11.如權(quán)利要求6所述的重組酶活性定量檢測方法，其特征在于，所述探針反應(yīng)體系包括：探針、反應(yīng)緩沖液以及h2o，所述反應(yīng)緩沖液包括tris-hcl、醋酸鉀、醋酸鎂、dtt。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種重組酶結(jié)合探針致熒光信號下降在酶活性檢測方面的應(yīng)用及檢測方法，屬于酶活性檢測技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明是以重組酶與探針結(jié)合，會使得探針熒光信號下降為原理，建立了重組酶結(jié)合探針時與熒光信號下降的關(guān)系，從而對重組酶的活性進(jìn)行定量檢測，本發(fā)明的檢測方法相對于現(xiàn)有的其它檢測方法，具有操作簡單、檢測效率高、定量準(zhǔn)確、可靠性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可規(guī)模化工業(yè)應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：李紅東,董宇,王星,朱牧孜,李明
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘇州天隆生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6