本申請屬于基因檢測，尤其涉及用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物、引物和探針、試劑盒及其非診斷目的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、移植物抗宿主病(graft-versus-host?disease,gvhd)是異基因造血細(xì)胞移植中最常見的威脅生命的并發(fā)癥之一，其主要因移植后供者的移植物中的t細(xì)胞在受者體內(nèi)被免疫反應(yīng)激活以獲得細(xì)胞溶解能力，然后攻擊攜帶外來抗原的細(xì)胞。其特征類似于自身免疫及其他免疫性疾病的癥狀，如：硬皮病、s-綜合征、免疫性血細(xì)胞減少癥等。目前診斷移植物抗宿主病主要依據(jù)患者移植后出現(xiàn)腹瀉、皮疹等病理表現(xiàn)及實驗室相關(guān)檢驗。

2、國外研究發(fā)現(xiàn)，多種生物標(biāo)志物可用于gvhd的潛在預(yù)測和早期檢測指標(biāo)，其中遺傳易感性在gvhd病因研究中具有重要性，多個研究證據(jù)支持gvhd的免疫學(xué)基礎(chǔ)和遺傳傾向。然而，尚未見易感基因tpmt、ugt2b10、bhlhe22、kiaa1715、gsta1、gstm1、cth、mthfr、cyp2b6、hfe、cps及hpse的基因組合試劑盒在兒童gvhd風(fēng)險評估中的相關(guān)報道。

3、目前為止，兒童移植物抗宿主病缺乏特征性病理診斷標(biāo)志物，兒童移植物抗宿主病更是缺乏標(biāo)準(zhǔn)及廣泛使用的診斷指南。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本申請實施例的目的在于提供了一種用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物、引物和探針、試劑盒及其應(yīng)用。

2、本申請實施例是這樣實現(xiàn)的，用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物，所述基因標(biāo)志物為tpmt基因、ugt2b10基因、bhlhe22基因、kiaa1715基因、gsta1基因、gstm1基因、cth基因、mthfr基因、cyp2b6基因、hfe基因、cps1基因以及hpse基因的組合。

3、優(yōu)選地，所述tpmt基因的snp位點為rs1800462、rs1800460以及rs1142345；所述ugt2b10基因的snp位點為rs17146905；所述bhlhe22基因的snp位點為rs16931326；所述kiaa1715基因的snp位點為rs2289971；所述gsta1基因的snp位點為rs3957356、rs11964968以及rs58912740；所述cth基因的snp位點為rs1021737；所述mthfr基因的snp位點為rs1801133、rs1801131；所述cyp2b6基因的snp位點為rs3745274；所述hfe基因的snp位點為rs1800562；所述cps1基因的snp位點為rs1047891；所述hpse基因的snp位點為rs4693608、rs4364254。

4、本申請實施例還提供了上述的用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物和/或其檢測試劑在制備兒童移植物抗宿主病檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用。

5、本申請實施例還提供了用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的引物和探針，包括snp位點引物、gstm1引物，內(nèi)參質(zhì)控引物、gstm1探針以及內(nèi)參質(zhì)控探針；

6、其中，所述snp位點引物是基于tpmt基因、ugt2b10基因、bhlhe22基因、kiaa1715基因、gsta1基因、cth基因、mthfr基因、cyp2b6基因、hfe基因、cps1基因以及hpse基因的snp位點設(shè)計而成，引物序列如seq?id?no.1～34所示；

7、所述gstm1引物是基于gstm1基因的indel位點設(shè)計而成的，引物序列如seq?idno.35～36所示；

8、所述內(nèi)參質(zhì)控引物是基于β-球蛋白設(shè)計而成，序列如seq?id?no.37～38所示；

9、所述gstm1探針是基于所述gstm1基因設(shè)計而成的，探針序列如seq?id?no.39所示；

10、所述內(nèi)參質(zhì)控探針是基于所述β-球蛋白設(shè)計而成的，探針序列如seq?id?no.40所示。

11、本申請實施例還提供了一種用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的試劑盒，所述試劑盒包括上述的用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物的檢測試劑。

12、優(yōu)選地，所述試劑盒包括上述的用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的引物和探針。

13、本申請實施例還提供了一種用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的試劑盒的非診斷目的應(yīng)用方法，包括：

14、使用上述的用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的試劑盒對待測外周血樣本的基因組dna進(jìn)行一輪pcr擴(kuò)增，得到snp位點擴(kuò)增產(chǎn)物以及gstm1擴(kuò)增產(chǎn)物；

15、對所述snp位點擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后采用建庫接頭引物進(jìn)行二輪pcr建庫擴(kuò)增，經(jīng)純化后，對所得文庫產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)測序，得測序數(shù)據(jù)；

16、對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控控制后回帖到基因組，統(tǒng)計比對基因組候選位點的正負(fù)鏈的基因型的覆蓋度信息，以基于所述覆蓋度信息，計算候選位點的基因型以及是否發(fā)生不平衡，并根據(jù)預(yù)設(shè)基因型風(fēng)險數(shù)據(jù)庫，判斷當(dāng)前基因型是否為風(fēng)險基因型；

17、對所述gstm1擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，以判斷gstm1是否純合缺失。

18、本申請首次發(fā)現(xiàn)兒童移植物抗宿主病和肝小靜脈閉塞癥患者外周血中tpmt、ugt2b10、bhlhe22、kiaa1715、gsta1、gstm1、cth、mthfr、cyp2b6、hfe、cps及hpse?12個基因標(biāo)志物的組合在gvhd與未發(fā)生gvhd的造血干細(xì)胞移植患兒之間具有顯著差異性，可作為輔助診斷gvhd的實驗室免疫相關(guān)檢測指標(biāo)之一，而且操作簡單可行，具有很高的臨床應(yīng)用價值。

19、本申請?zhí)峁┑挠糜陬A(yù)測兒童移植物抗宿主病的試劑盒，針對17個snp位點及1個基因型別純合缺失進(jìn)行檢測，結(jié)合高通量測序與毛細(xì)管電泳相結(jié)合的方法完成基因分型，可根據(jù)患者的分型結(jié)果，進(jìn)一步給出風(fēng)險評估，實現(xiàn)個體化易感基因檢測。

技術(shù)特征：

1.用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物，其特征在于，所述基因標(biāo)志物為tpmt基因、ugt2b10基因、bhlhe22基因、kiaa1715基因、gsta1基因、gstm1基因、cth基因、mthfr基因、cyp2b6基因、hfe基因、cps1基因以及hpse基因的組合。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物，其特征在于，所述tpmt基因的snp位點為rs1800462、rs1800460以及rs1142345；所述ugt2b10基因的snp位點為rs17146905；所述bhlhe22基因的snp位點為rs16931326；所述kiaa1715基因的snp位點為rs2289971；所述gsta1基因的snp位點為rs3957356、rs11964968以及rs58912740；所述cth基因的snp位點為rs1021737；所述mthfr基因的snp位點為rs1801133、rs1801131；所述cyp2b6基因的snp位點為rs3745274；所述hfe基因的snp位點為rs1800562；所述cps1基因的snp位點為rs1047891；所述hpse基因的snp位點為rs4693608、rs4364254。

3.一種權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物和/或其檢測試劑在制備兒童移植物抗宿主病檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用。

4.用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的引物和探針，其特征在于，包括snp位點引物、gstm1引物，內(nèi)參質(zhì)控引物、gstm1探針以及內(nèi)參質(zhì)控探針；

5.一種用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物的檢測試劑。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求4所述的用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的引物和探針。

7.一種用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的試劑盒的非診斷目的應(yīng)用方法，其特征在于，包括：

技術(shù)總結(jié)
本申請適用于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，提供了用于預(yù)測兒童移植物抗宿主病的基因標(biāo)志物、引物和探針、試劑盒及其應(yīng)用。本申請首次發(fā)現(xiàn)兒童移植物抗宿主病和肝小靜脈閉塞癥患者外周血中TPMT、UGT2B10、BHLHE22、KIAA1715、GSTA1、GSTM1、CTH、MTHFR、CYP2B6、HFE、CPS及HPSE?12個基因標(biāo)志物的組合在GVHD與未發(fā)生GVHD的造血干細(xì)胞移植患兒之間具有顯著差異性，可作為輔助診斷GVHD的實驗室免疫相關(guān)檢測指標(biāo)之一，而且操作簡單可行，具有很高的臨床應(yīng)用價值。本申請?zhí)峁┑挠糜陬A(yù)測兒童移植物抗宿主病的試劑盒，針對17個SNP位點及1個基因型別純合缺失進(jìn)行檢測，結(jié)合高通量測序與毛細(xì)管電泳相結(jié)合的方法完成基因分型，可根據(jù)患者的分型結(jié)果，進(jìn)一步給出風(fēng)險評估，實現(xiàn)個體化易感基因檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：鄭仲征,盧瑞鵬,王瑋光,董香開
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳荻碩貝肯精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6