本發(fā)明屬于生物，具體涉及了一種與多酚氧化酶結(jié)合的鯊源單域抗體及其應用。

背景技術：

1、黑變(melanosis)是指甲殼動物死后軀干和受傷部位交界處產(chǎn)生黑點的現(xiàn)象，由一系列自動氧化和聚合反應引起，黑變是甲殼動物質(zhì)量下降的典型特征。多酚氧化酶(polyphenol?oxidase，ppo)是導致黑變的關鍵酶。多酚氧化酶是一種含有銅離子的金屬酶，能夠激活分子氧化并催化酚類化合物的羥基化，廣泛存在于動物、植物、微生物和真菌當中。ppo與酶促褐變反應有關，在動物中會引起黑色素的形成。因此，開發(fā)一種特異性結(jié)合多酚氧化酶的納米抗體，為開發(fā)ppo特異性抑制劑、延緩對蝦黑變，提高對蝦的商業(yè)價值提供理論參考。1993年，生物學家從駱駝血清中發(fā)現(xiàn)天然缺失輕鏈的重鏈抗體，其是由兩條重鏈組成的同源二聚體。經(jīng)多年研究，flajinik等人在軟骨魚類中也發(fā)現(xiàn)天然的重鏈抗體，此類重鏈抗體被命名為免疫球蛋白新抗原受體(immunoglobulin?new?antigen?receptor，ignar)。ignar的抗原結(jié)合片段被稱為新抗原受體可變區(qū)(variabledomain?ofimmunoglobulin?new?antigen?receptor，vnar)，位于單條重鏈的末端。vnar的分子量約為12kda，只有傳統(tǒng)單克隆抗體的十分之一大小，是目前已知的最小抗原結(jié)合單位，也被稱為單域抗體。因為單域抗體分子量小，也被稱為納米抗體(nanobody)，是目前已知最小的天然抗體片段。單域抗體穩(wěn)定性高、結(jié)構較為簡單、尺寸較小，通常需要較少的代謝能量來合成和折疊，因此容易在多種微生物中大量表達，例如大腸桿菌、酵母等系統(tǒng)，這一獨特優(yōu)勢使其更易工業(yè)化應用。此外，單域抗體可以快速穿透組織屏障，并保持其高特異性和親和力，可有效克服傳統(tǒng)抗體的局限性，這使其成為了抗體療法的有效補充。因此，單域抗體在藥物研發(fā)、疾病診斷和治療等領域具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳吧袩o與多酚氧化酶結(jié)合的鯊源單域抗體。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決背景技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種與多酚氧化酶結(jié)合的鯊源單域抗體及其應用。本發(fā)明提供了能以高親和力結(jié)合多酚氧化酶的鯊源重鏈抗體可變區(qū)序列，對多酚氧化酶的檢測、抑制對蝦等水產(chǎn)品黑變以提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全至關重要。

2、本發(fā)明所采用的技術方案如下：

3、一、一種與多酚氧化酶結(jié)合的鯊源單域抗體：

4、所述鯊源單域抗體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、所述鯊源單域抗體編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

6、所述鯊源單域抗體在制備多酚氧化酶濃度檢測試劑中的應用。

7、所述鯊源單域抗體在制備蝦黑變抑制試劑中的應用。

8、二、一種鯊源單域抗體的多酚氧化酶濃度檢測方法，包括以下步驟：

9、步驟s1、首先，設置標準品組、樣本組和空白組，所述標準品組向免疫孔板中加入不同濃度的多酚氧化酶標準品，所述樣本組向免疫孔板中加入待測的多酚氧化酶樣本，所述空白組不向免疫孔板中加入任何樣品；

10、多酚氧化酶標準品一般是指已知濃度的多酚氧化酶試劑盒。

11、步驟s2、往標準品組、樣本組和空白組中加入鯊源單域抗體，并測得加入鯊源單域抗體后標準品組和樣本組的吸光度od450值；

12、步驟s3、根據(jù)標準品組和樣本組的吸光度od450值，得到待測樣本組的多酚氧化酶濃度。

13、所述的步驟s2具體為：利用脫脂牛奶分別對標準品組、樣本組和空白組進行封閉處理，然后往標準品組、樣本組和空白組的免疫孔板中加入鯊源單域抗體，孵育后用pbst洗免疫孔板，免疫孔板的每孔加入山羊抗人igg?fc-hrp抗體，孵育后再次用pbst洗免疫孔板，然后每孔加入tmb顯色，顯色后加入硫酸h2so4終止反應，分別測得標準品組、樣本組和空白組的吸光度od450值，接著分別將標準品組和樣本組的吸光度od450值減去空白組的吸光度od450值，得到標準品組和樣本組校正后的吸光度od450值。

14、所述的步驟s3具體為：根據(jù)標準品組中多酚氧化酶標準品的濃度和校正后的吸光度od450值，繪制吸光度od450值的標準曲線，利用吸光度od450值的標準曲線，得到樣本組校正后的od450值對應的濃度即為樣本組的多酚氧化酶濃度。

15、具體地，將標準品組中多酚氧化酶標準品的濃度作為橫坐標，對應的校正后吸光度od450值作為縱坐標，進行線性回歸分析得到吸光度od450值的標準曲線。

16、三、一種與多酚氧化酶結(jié)合的鯊源單域抗體的制備方法，包括以下步驟：

17、步驟s1：篩選特異性單域抗體；

18、步驟s2：單域抗體重組表達，制得鯊源單域抗體。

19、所述的步驟s1具體為：

20、s11、首先將現(xiàn)有的鯊源單域抗體合成文庫接種到液體培養(yǎng)基中，然后往液體培養(yǎng)基中加入輔助噬菌體以促進噬菌體的增殖，經(jīng)靜置培養(yǎng)和離心收集噬菌體后，將噬菌體震蕩培養(yǎng)過夜以獲取更多噬菌體，接著利用peg聚乙二醇沉淀法富集噬菌體獲取富集的噬菌體的滴度；

21、s12、將多酚氧化酶溶于無蛋白溶液gfbe中制得多酚氧化酶溶液，再將0.1mg/ml的多酚氧化酶溶液包被于免疫孔板中作為多酚氧化酶組，并將未包被多酚氧化酶溶液的免疫孔板作為陰性對照組，分別向多酚氧化酶組和陰性對照組的免疫孔板中加入s11富集的噬菌體使得噬菌體與多酚氧化酶組中的多酚氧化酶結(jié)合，再用pbst(磷酸緩沖液)對免疫孔板進行洗滌，洗滌后分別得到多酚氧化酶組和陰性對照組中脫落的噬菌體；

22、s13、將多酚氧化酶組和陰性對照組的噬菌體侵染tg1細菌(大腸桿菌)，然后將侵染tg1細菌的噬菌體涂布于平板上，培養(yǎng)12h后得到單菌落，對多酚氧化酶組和陰性對照組的單菌落數(shù)量進行計數(shù)和對比：

23、若多酚氧化酶組的單菌落數(shù)量大于陰性對照組數(shù)量的10倍，則表明多酚氧化酶組的單菌落數(shù)量滿足要求，進入s14；

24、否則，回到s12重新制備新的噬菌體直到多酚氧化酶組的單菌落數(shù)量滿足要求；

25、s14、選取多酚氧化酶組中的單菌落置于免疫孔板中，加入輔助噬菌體，擴增得到單克隆噬菌體；

26、s15、利用多酚氧化酶溶液包被單克隆噬菌體所在的免疫孔板，再向免疫孔板中加入辣根過氧化物酶標記的噬菌體特異性抗體，接著加入tmb(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)顯色液對單克隆噬菌體進行顯色反應，對吸光度od450＞1的單克隆噬菌體進行測序利用序列比對軟件去除重復序列，將測序并去除重復序列后得到的核苷酸序列作為鯊源單域抗體的編碼基因的核苷酸序列。其中，s1得到的核苷酸序列具有多酚氧化酶特異性。

27、所述s2具體為：

28、將鯊源單域抗體的編碼基因構建至真核表達載體ptt5-tev-fc中，再利用hek293f(人胚腎細胞)細胞進行表達，經(jīng)瓊脂糖凝膠rprotein?a親和層析柱純化得到所述鯊源單域抗體(即特異性針對多酚氧化酶的單域抗體-fc融合蛋白)。

29、四、鯊源單域抗體表征，包括以下步驟：

30、s31、多酚氧化酶抗原以1μg/ml的濃度包被至免疫板上，無蛋白溶液為陰性對照組，4℃包被過夜，次日，移除液體，磷酸鹽緩沖液pbs洗滌，mpbs(磷酸緩沖液加上5％牛奶)封閉，隨后，將所表達抗體按梯度稀釋多個濃度加入孔中孵育，孵育后pbst(磷酸緩沖液加上0.1％?tween-20)洗孔，加山羊抗人igg?fc-hrp抗體孵育后，再清洗，tmb顯色，硫酸h2so4終止，測得od450值，并擬合得到抗體的半數(shù)效應濃度ec50值。

31、s32、實驗開始前需使用200μl的磷酸鹽緩沖液(pbst)對傳感器進行10min的預濕潤處理。實驗流程如下：抗原多酚氧化酶首先經(jīng)過生物素化處理，以500nm載入sa生物傳感器，固化值在1.0nm，然后與梯度稀釋的16-11g-fc在室溫下孵育240s，解離240s。

32、本發(fā)明利用已構建好的鯊源單域抗體合成文庫，通過對多酚氧化酶進行生物淘選，最終分離獲得1株高親和力單域抗體，并將其命名為16-11g，核苷酸序列和氨基酸序列分別如下：

33、核苷酸序列：

34、gcacaacgggttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccagctatgcattgggtagcacgtactggtatttcacaaaaaagggcgcaacaaagaaggcgagcttatcaactggcggacgatactcggacacaaagaatacggcatcaaagtccttttccttgcgaattagtgacctaagagttgaagacagtggtacatatcactgtaaagcgtatttccatactcctcattacgctcatgtccctacttgggagcgggcggaggaaggaggcgg?caccattctgactgtaaaagca

35、氨基酸序列：

36、aqrveqtpttttkeagesltincvlkgssyalgstywyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhckayfhtphyahvptweraeegggtiltvk

37、所述單域抗體包括2個抗原互補決定區(qū)(complementarity?determining?region，cdr1、cdr3)，分別為第一個抗原互補決定區(qū)cdr1和第二個抗原互補決定區(qū)cdr3，2個抗原互補決定區(qū)的序列如下：

38、cdr1：kgssyalgstyw

39、cdr3：fhtphyahvptwerae

40、將單域抗體16-11g與人igg1?fc段融合后，克隆至ptt5載體，采用哺乳動物細胞293f進行分泌性表達，表達3天后，采用rprotein?a親和層析柱純化培養(yǎng)上清中的16-11g-fc融合蛋白，發(fā)現(xiàn)抗體的產(chǎn)量在12mg/l以上。

41、16-11g抗體能高親和力的結(jié)合多酚氧化酶。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗elisa檢測顯示，本公開的16-11g-fc抗體結(jié)合多酚氧化酶的親和力為6.48nm。生物膜干涉實驗(biolayer?interferometry，bli)表明，多酚氧化酶與16-11g-fc抗體的平衡解離常數(shù)(equilibrium?dissociation?constant，kd)為2885nm。

42、本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點：

43、1、由于本發(fā)明的單域抗體來源于鯊魚重鏈抗體，因此其具備穩(wěn)定性高、表達量高以及親和力高的特點，鯊源單域抗體能穩(wěn)定地檢測多酚氧化酶的濃度。

44、2、本發(fā)明的鯊源單域抗體分子量小、溶解度高、易重組表達、具有良好的熱穩(wěn)定性、強折疊能力、良好的組織滲透性、聚合傾向低和強大的靶向結(jié)合能力。

45、3、本發(fā)明篩選得到的單域抗體展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、高特異性以及高親和力，為后續(xù)以多酚氧化酶的檢測、抑制對蝦等水產(chǎn)品黑變以提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了理論基礎。