本發(fā)明屬于生物化學與分子生物學，涉及一種dna提取方法，具體涉及一種可以直接用于pcr的茶樹組織快速dna提取方法。

背景技術(shù)：

1、基因組dna是生物體重要的遺傳物質(zhì)。高效且快速地提取基因組dna是開展各類分子檢測不可或缺的前提和基礎(chǔ)，是分子生物學研究最基本步驟之一。在植物中，常含有大量如多糖、色素、酚類等物質(zhì)，極容易污染所提取的dna，并對后續(xù)基于酶活性的實驗，例如pcr及酶切反應等產(chǎn)生不利影響。因此從植物材料中，尤其是從富含酚類且高度角質(zhì)化和臘質(zhì)化的木本植物組織中提取dna有較大難度。茶樹，是山茶科山茶屬常綠灌木或小喬木，為我國重要的經(jīng)濟作物，富含酚類物質(zhì)，在鮮葉中其含量可達干物質(zhì)含量的1/3。此外，其含有的大量生物堿及其它多種次生代謝物質(zhì)也極大的影響基因組dna的獲得率。而不同的生長環(huán)境、不同品種、不同組織部位之間的次生代謝物的成分及含量也存在較大差異，因而采用傳統(tǒng)的提取方法提取茶樹dna往往不能獲得滿意的效果。

2、植物dna提取方法有:ctab法、sds法、高鹽低ph法、尿素法、異硫氰酸胍法等。茶樹組織常用ctab(袁長春等.,2001；黃建安等.,2003)和sds法(羅軍武等.,2002；陳亮等.,1997；唐祥凱等.,2015；游小妹等.,2008)。雖然根據(jù)茶樹次生代謝蓄積量高的特點改進后的ctab法和sds法能有效去除蛋白質(zhì)、多糖和酚類等雜質(zhì)，提取的dna純度好、產(chǎn)量高，但此法在提取過程中，需反復離心、抽提，長時間的沉淀，洗滌等步驟，甚至需要先提純細胞核，再裂解釋放基因組dna，因此存在步驟復雜、操作繁瑣，耗時長等不足。在裂解、雜質(zhì)去除等環(huán)節(jié)使用酚和氯仿等腐蝕性強，劇毒的試劑，不僅危害人體健康同時也對環(huán)境造成污染。目前報道的茶樹基因組提取方法，在提取樣本組織方面也有所限制，大多需使用柔嫩的芽葉組織，而目前茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中愈傷組織以及發(fā)根農(nóng)桿菌介導的發(fā)根轉(zhuǎn)化仍占主導地位。另一方面，繁雜的dna提取方法很難滿足樣品高通量檢測的需要，尤其是在面對由于茶樹遺傳轉(zhuǎn)化效率偏低導致的龐大的轉(zhuǎn)基因待測樣本，以及在進行品種純度鑒定和種質(zhì)資源鑒定時，dna提取耗費大量的時間、人力和物力。盡管試劑盒的使用簡化了一些步驟，但由于多酚類植物通常又需要增加額外的處理，因此在用于提取茶樹組織時，時間節(jié)約上并沒有太顯著，并且由此提高的經(jīng)濟成本也讓有些研究者難以接受。最近發(fā)表了簡化的可直接用于pcr的茶樹基因組dna快速提取法(申超峰等.,2020)，步驟如下：樣品研磨→室溫放置10min→加入1/10體積3m?naac(ph?5.2)溶液混勻→加入等體積氯仿:異戊醇:乙醇(80:4:16)充分混勻→靜置5min→10000rpm，4℃，離心10min→取上清液→加入等體積的異丙醇(預冷)混勻→-20℃放置20min→10000rpm離心10min→去上清液，收集沉淀→加入75％乙醇清洗→再一次加入75％乙醇漂洗→加入50μl?te溶解，即為茶樹基因組dna。該方法仍需要經(jīng)過氯仿的純化，異丙醇的沉淀，以及沉淀后的多次漂洗等多個步驟。因此發(fā)明人開發(fā)一種更快速簡單的茶樹組織dna提取法，該方法不需要經(jīng)多次純化和漂洗沉淀，可直接用于pcr鑒定，且適用于茶樹不同組織包括不同葉位的葉、根、莖、愈傷組織、花等，同時適用于不同的茶樹品種，及其他山茶屬植物。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種可直接用于pcr的茶樹組織快速dna提取方法。本發(fā)明中通過對緩沖液的改進，最大限度降低多糖、色素、酚類等物質(zhì)的影響，同時本技術(shù)中對提取條件進行了改進，使得dna提取方法效率大大提升。

2、本發(fā)明的目的至少通過如下技術(shù)方案之一實現(xiàn)。

3、一種可以直接用于pcr的茶樹快速dna提取方法，包括以下步驟：

4、(1)取茶樹組織樣品2～10mg，碾磨植物組織，加入80～100μl提取緩沖液，繼續(xù)碾磨至呈漿狀，得到漿狀茶樹組織樣品；

5、(2)將步驟(1)中所得的漿狀茶樹組織樣品于95～100℃煮10～20min；優(yōu)選100℃煮10min；

6、(3)加入無菌ddh2o，混勻，離心，取上清液作為模版進行pcr檢測。

7、優(yōu)選地，所述茶樹組織樣品選用開發(fā)的簡易打孔取樣裝置(200μl移液器吸頭倒扣在葉片上方，葉片下端對齊0.5ml離心管口，稍微出力按壓吸頭和離心管)打孔取圓型葉片，避開主葉脈，重約8mg(圖1)。

8、優(yōu)選地，步驟(1)具體為：取茶樹組織樣品2～10mg，裝入離心管中，使用移液器吸頭或微型研磨棒碾磨植物組織8～15s后，加入80～100μl提取緩沖液，繼續(xù)碾磨12～30s至呈漿狀。

9、優(yōu)選地，步驟(3)中所述無菌ddh2o的加入量為緩沖液體積的5～10倍。

10、優(yōu)選地，步驟(3)中，所述混勻為顛倒5～10次。

11、優(yōu)選地，所述茶樹組織樣品選用10mg新鮮的植物樣本或2mg成品茶。

12、優(yōu)選地，新鮮的植物樣本為愈傷組織、側(cè)根、花蕾、花瓣、花蕊、葉片、莖段；所述成品茶為不發(fā)酵成品茶干樣。

13、優(yōu)選地，步驟(1)所述磨樣方式也可使用液氮速凍樣品，研磨成粉末后加入緩沖液混勻。具體為：取茶樹組織樣品2～10mg，在液氮中一次性研磨成粉末后直接加入80～100μl提取緩沖液，震蕩混勻，得到漿狀茶樹組織樣品。

14、優(yōu)選地，所述提取緩沖液成分為100～250mm?tris-hcl,ph8.0；0.9～1.5m?kcl；1～10mm?edta,ph8.0；1～2％triton-x100；2～20mm?dtt。

15、作為優(yōu)選案例，所述提取緩沖液成分為100mm?tris-hcl,ph8.0；1m?kcl；10mmedta,ph8.0；1％?triton-x100；20mm?dtt。

16、優(yōu)選地，步驟(1)所述加入提取緩沖液計量如下：8mg(含)以上樣品按10μl(緩沖液)/mg(鮮樣品)計量，即8mg樣品加80μl提取緩沖液；8mg以下樣品，加入80μl提取緩沖液，以免液體太少容易煮干。

17、優(yōu)選地，步驟(1)所述加入提取緩沖液按80μl(緩沖液)/mg(成品干茶樣品)計量，即2mg成品茶樣品需160μl提取緩沖液。

18、優(yōu)選地，步驟(3)中，所述離心轉(zhuǎn)速為10000～14000rpm優(yōu)選12000rpm，時間為30s～3min，優(yōu)選1min，溫度為室溫，上清液即為茶樹基因組dna，直接用作為pcr模版。

19、優(yōu)選地，步驟(3)中，所述pcr檢測具體為：取稀釋液作為模版進行pcr檢測，引物使用位于茶樹翻譯延伸因子編碼基因csef-1α內(nèi)的正向引物ef1semi-f1和反向引物ef1semi-r1，擴增片段長度為513bp；

20、pcr體系為總體積15μl，其中模版1.5μl，10μm上、下游引物各0.4μl，2×的pcr?taq酶混合液7.5μl，ddh2o?5.2μl；

21、pcr反應程序：①95℃，4～7min；②95℃，30s；③54～57℃，30s；④72℃，40s～2min；⑤重復②③④共35～44次循環(huán)；⑥72℃，6～10min。

22、優(yōu)選的，pcr體系為總體積15μl，其中模版1.5μl，10μm上、下游引物各0.4μl，2×的pcr?taq酶混合液7.5μl，ddh2o5.2μl；

23、pcr反應程序：①95℃，4min；②95℃，30s；③54℃，30s；④72℃，40s；⑤重復②③④共35次循環(huán)；⑥72℃，6min。

24、本發(fā)明能高效快速的獲得各種茶樹組織的dna的關(guān)鍵在于：

25、(1)提取緩沖液中添加的1％?triton-x100在100℃高溫下有助于快速破壞茶樹細胞膜、核膜，并釋放基因組dna，二者缺一不可(參見對比例中的s3和s4)，同時使用是本方法的關(guān)鍵點；

26、(2)提取緩沖液中添加的dtt不僅可以抑制茶樹樣品在裂解時的褐化情況，還有助于提高pcr時酶的活性；

27、(3)快速緩沖液中tris-hcl的ph8.0為茶樹dna提取的最適ph值，更高的ph(9.2)值會導致樣品高溫時容易褐化。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明提供的茶樹組織dna提取方法具有如下優(yōu)點：

29、(1)操作簡單：本發(fā)明提供的提取方法操作步驟簡單，只需要一種提取緩沖液，不需要反復抽提純化，也沒有復雜的儀器設備，可適用于高通量的樣品檢測；

30、(2)安全：不需要使用苯酚、氯仿、異戊醇等有毒有機化學試劑；

31、(3)經(jīng)濟：本發(fā)明所用的試劑種類少，且沒有昂貴試劑，成本低；

32、(4)適性用廣：本發(fā)明提供的茶樹組織dna提取方法，可用于茶樹各個組織(根、莖、葉、花、愈傷組織等)，也可用于不同的茶樹品種以及山茶屬的其他木本植物，還可用于不發(fā)酵的成品茶；

33、(5)樣品需求量少：普通組織樣品8mg足以，對于某些珍貴的轉(zhuǎn)基因材料可降至2mg，干茶樣品可只用2mg；

34、(6)對植株傷害?。阂蛉〔牡慕M織部位不受限且樣品需求量少，因此可最大限度的減少對珍貴種質(zhì)材料的傷害。