本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及檢測(cè)呼吸道感染相關(guān)病原體，包括冠狀病毒、百日咳桿菌、a族鏈球菌、副流感病毒、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，以及肺炎衣原體的檢測(cè)并區(qū)分的組合物。

背景技術(shù)：

1、冠狀病毒家族已知的至少有幾十個(gè)成員，其中的大多數(shù)與我們?nèi)祟?lèi)相安無(wú)事，而經(jīng)過(guò)多次變異產(chǎn)生的sars-cov，mers-cov等7種冠狀病毒可以感染人類(lèi)。

2、肺炎衣原體(chlamydia?pneumoniae，cp)感染是一個(gè)呼吸道傳播的傳染病。傳播途徑是通過(guò)肺炎衣原體患者的飛沫或噴嚏，被健康人呼吸入呼吸道；肺炎衣原體在后者呼吸道細(xì)胞里生長(zhǎng)、繁殖及侵襲，從而造成感染狀態(tài)。

3、肺炎鏈球菌(streptococcus?pneumoniae，sp)是一種菌體，它是革蘭染色體呈現(xiàn)雙排短鏈的雙球菌，一般肺炎鏈球菌可以使患者出現(xiàn)肺炎、腦膜炎以及支氣管炎等多種疾病。傳播途徑是通過(guò)肺炎鏈球菌患者的飛沫或噴嚏，被健康人呼吸入呼吸道；起病多急驟(少數(shù)患兒先有輕微的上呼吸道感染癥狀)，中毒癥狀重。突然高熱、體溫可達(dá)40℃～41℃，頭痛、胸痛、呼吸急促，煩躁不安，早期往往不咳嗽或輕咳，病兒常不吐痰。年長(zhǎng)兒可有寒戰(zhàn)、咯吐鐵銹色痰，但有的患兒仍咳黃膿痰。重癥患兒可有驚厥、譫妄及昏迷等中毒性腦病表現(xiàn)。

4、流感嗜血桿菌(haemophilus?iinfluenzae，hi)自然產(chǎn)生的疾病只會(huì)在人類(lèi)出現(xiàn)。在嬰兒及孩童中，乙型流感嗜血桿菌會(huì)引致菌血病癥及急性細(xì)菌性腦膜炎。偶爾地它會(huì)引致蜂窩組織炎、骨髓炎及關(guān)節(jié)感染。

5、副流感病毒可以引起人們的主要疾病有：普通感冒、支氣管炎、細(xì)支氣管炎和肺炎等，與副流感病毒相似的鼻病毒、冠狀病毒、腺病毒等也可以引起普通感冒，甚至支氣管炎。副流感病毒則分為四型，即piv1-4。

6、a族鏈球菌單個(gè)菌體呈球形或卵圓形，直徑約1μm。排列成鏈狀或成雙排列，鏈的長(zhǎng)短受環(huán)境因素影響而不同。革蘭染色陽(yáng)性。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)或菌體死亡，可表現(xiàn)為革蘭染色陰性。無(wú)鞭毛，不形成芽胞。a族鏈球菌有發(fā)絲樣m蛋白，外包裹脂磷壁酸的菌毛結(jié)構(gòu)。大多數(shù)a族鏈球菌培養(yǎng)早期(2～4小時(shí))可形成透明質(zhì)酸莢膜，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，由于細(xì)菌產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶而將其降解后消失。

7、因此，本領(lǐng)域需求一種能夠簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)上述病原體并且靈敏度高、特異性好的產(chǎn)品，有利于為臨床及時(shí)提供治療策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，第一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)呼吸道感染相關(guān)病原體的組合物，包括檢測(cè)如下相關(guān)病原體中至少4種的上下游引物和探針：

2、如seq?id?no:1～3所示的檢測(cè)冠狀病毒的上下游引物和探針；

3、如seq?id?no:4～6所示的檢測(cè)百日咳桿菌的上下游引物和探針；

4、如seq?id?no:7～9所示的檢測(cè)a族鏈球菌的上下游引物和探針；

5、如seq?id?no:10～12所示的檢測(cè)副流感病毒的上下游引物和探針；

6、如seq?id?no:13～15所示的檢測(cè)肺炎鏈球菌的上下游引物和探針；

7、如seq?id?no:16～18所示的檢測(cè)流感嗜血桿菌的上下游引物和探針；或

8、如seq?id?no:19～21所示的檢測(cè)肺炎衣原體的上下游引物和探針。

9、本發(fā)明提供的聯(lián)檢組合物，主要利用多重?zé)晒鈖cr分析方法對(duì)相關(guān)病原體進(jìn)行檢測(cè)，從而在單管反應(yīng)體系中同時(shí)實(shí)現(xiàn)冠狀病毒、百日咳桿菌、a族鏈球菌、副流感病毒、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，以及肺炎衣原體中至少4種病原體的檢測(cè)和區(qū)分，以便為后續(xù)治療提供針對(duì)性策略。同時(shí)，本發(fā)明的組合物，其檢測(cè)的靈敏度更高，達(dá)到500拷貝/ml，相比熔解曲線，其檢測(cè)更為準(zhǔn)確，有利于及時(shí)提供預(yù)防政策。

10、進(jìn)一步地，所述組合物包括上述病原體中至少5種的上下游引物和探針。

11、進(jìn)一步地，所述組合物包括上述病原體中至少6種的上下游引物和探針。

12、本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)呼吸道感染相關(guān)病原體的組合物，包括：

13、如seq?id?no:1～3所示的檢測(cè)冠狀病毒的上下游引物和探針；

14、如seq?id?no:4～6所示的檢測(cè)百日咳桿菌的上下游引物和探針；

15、如seq?id?no:7～9所示的檢測(cè)a族鏈球菌的上下游引物和探針；

16、如seq?id?no:10～12所示的檢測(cè)副流感病毒的上下游引物和探針；

17、如seq?id?no:13～15所示的檢測(cè)肺炎鏈球菌的上下游引物和探針；

18、如seq?id?no:16～18所示的檢測(cè)流感嗜血桿菌的上下游引物和探針；以及

19、如seq?id?no:19～21所示的檢測(cè)肺炎衣原體的上下游引物和探針。

20、進(jìn)一步地，所述組合物包括檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的上下游引物及探針。

21、在一些具體的實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)是人源內(nèi)標(biāo)基因。

22、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)是人管家基因。

23、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述組合物包括如seq?id?no:22～24所示的檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的上下游引物及探針。

24、進(jìn)一步地，本發(fā)明組合物中不同探針的熒光基團(tuán)彼此互不相同且互不干擾。

25、在本文中，“互不相同且互不干擾”是指組合物中每個(gè)探針?biāo)玫臒晒饣鶊F(tuán)是不一樣的，并且不會(huì)影響彼此的檢測(cè)，即可以利用不同的通道進(jìn)行檢測(cè)。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox、cy5、cy7以及cy5.5等，這些基團(tuán)吸光值不接近，能選擇不同的通道，因而不會(huì)互相干擾。

26、進(jìn)一步地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以同時(shí)包括上述引物和探針組中的一組或多組。在本發(fā)明中，“組”是指檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的上游引物、下游引物和探針。

27、本發(fā)明的組合物可以任意組合成檢測(cè)對(duì)應(yīng)8個(gè)靶點(diǎn)的任意組合形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行組合，檢測(cè)哪幾個(gè)靶點(diǎn)，即把對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的引物和探針對(duì)進(jìn)行組合即可。這些組合形式均包括在本發(fā)明中。

28、舉例來(lái)說(shuō)，可以包括上述8組引物和探針中的任意7組，可以包括上述8組引物和探針中的任意6組，可以包括上述8組引物和探針中的任意5組，可以包括上述8組引物和探針中的任意4組，可以包括上述8組引物和探針中的任意3組，可以包括上述6組引物和探針中的任意2組，也可以包括上述8組引物和探針中的任意1組。

29、在一些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物用于熒光pcr。

30、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，冠狀病毒探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為fam；百日咳桿菌探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為hex；a族鏈球菌探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為rox；副流感病毒探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為cy5；肺炎鏈球菌探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為quasar?705；流感嗜血桿菌探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為atto425；肺炎衣原體探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為cy7。

31、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)的熒光報(bào)告基團(tuán)為af?405。

32、進(jìn)一步地，探針的3’末端還具有非熒光淬滅劑。

33、進(jìn)一步地，探針的3’末端還具有淬滅基團(tuán)，例如mgb、dabcyl?bhq-0、bhq1、bhq2或bhq3。

34、進(jìn)一步地，所述組合物中單條引物的用量為0.01～0.5μm；所述組合物中單條探針的用量為0.005～0.2μm。

35、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的各成分分別存在于單獨(dú)包裝中。

36、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的各成分存在于同一個(gè)包裝中。

37、進(jìn)一步地，本發(fā)明的組合物的各成分以混合的形式存在。

38、第二方面，本發(fā)明提供了上述本發(fā)明的組合物在制備用于檢測(cè)呼吸道感染相關(guān)病原體的試劑盒中的用途，其中，所述相關(guān)病原體的類(lèi)型為冠狀病毒、百日咳桿菌、a族鏈球菌、副流感病毒、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，或肺炎衣原體中的一種或多種。

39、第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)呼吸道感染相關(guān)病原體的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述本發(fā)明的組合物。

40、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。

41、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，陰性質(zhì)控品是depc?h2o、生理鹽水、內(nèi)標(biāo)基因中的至少一種。陽(yáng)性質(zhì)控品是冠狀病毒、百日咳桿菌、a族鏈球菌、副流感病毒、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，或肺炎衣原體的假病毒、質(zhì)?；蚱位蛑械闹辽僖环N。

42、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括核酸擴(kuò)增試劑。

43、更進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增試劑包括dntp(u)s、pcr緩沖液、dna聚合酶，以及mg2+中的至少一種。

44、更進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括：核酸釋放試劑、核酸提取試劑。

45、進(jìn)一步地，所述dna聚合酶的濃度為1u/反應(yīng)～15u/反應(yīng)，例如dna聚合酶可以是taq酶。

46、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒包括：taq酶、mg2+、dntp(u)s、引物、探針、ung酶和pcr緩沖液。

47、pcr緩沖液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton?x-100等組分構(gòu)成。一般單個(gè)pcr反應(yīng)管中總體積為20μl～200μl。

48、第四方面，提供了一種用于用于檢測(cè)呼吸道感染相關(guān)病原體的方法，所述方法包括以下步驟：

49、1)提取待測(cè)樣本的核酸；

50、2)使用如上所述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光定量pcr；

51、3)獲得并分析結(jié)果。

52、在本發(fā)明中，用于檢測(cè)的樣本可以是血清、血液等，但不限于此。

53、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

54、逆轉(zhuǎn)錄，溫度為50～65℃，時(shí)間為1～5分鐘，1次循環(huán)；預(yù)變性，溫度為90～99℃，時(shí)間為1～5分鐘，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時(shí)間為5～30秒，退火，溫度為55℃～60℃，時(shí)間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

55、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供了一種用于以非診斷目的的用于檢測(cè)呼吸道感染相關(guān)病原體的方法，所述方法包括以下步驟：

56、1)提取待測(cè)樣本的核酸；

57、2)使用如上述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光定量pcr；

58、3)獲得并分析結(jié)果。

59、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

60、逆轉(zhuǎn)錄，溫度為50～65℃，時(shí)間為1～5分鐘，1次循環(huán)；預(yù)變性，溫度為90～99℃，時(shí)間為1～5分鐘，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時(shí)間為5～30秒，退火，溫度為55℃～60℃，時(shí)間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

61、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供了一種組合物用于制備用于檢測(cè)呼吸道感染相關(guān)病原體的試劑的用途，所述用途檢測(cè)以下步驟：

62、1)提取待測(cè)樣本的核酸；

63、2)使用如上述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光定量pcr；

64、3)獲得并分析結(jié)果。

65、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

66、逆轉(zhuǎn)錄，溫度為50～65℃，時(shí)間為1～5分鐘，1次循環(huán)；預(yù)變性，溫度為90～99℃，時(shí)間為1～5分鐘，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時(shí)間為5～30秒，退火，溫度為55℃～60℃，時(shí)間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

67、在本文中，術(shù)語(yǔ)“非診斷目的”指并非旨在獲得個(gè)體是否感染上述病原體并罹患感染的信息。例如，該方法可以檢測(cè)環(huán)境以及培養(yǎng)物是否有上述病原體。