本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種共表達trim11和apoe2的核酸序列構建體及其應用。

背景技術：

1、癡呆癥是一種綜合癥，可以由多種疾病引起，這些疾病會隨著時間的推移破壞神經(jīng)細胞并損害大腦，通常會導致認知功能(即處理思維的能力)退化，記憶力、思想、行為和社會技能持續(xù)下降，這些變化會影響個人自理能力。目前，全世界有超過5500萬人患癡呆癥，其中60％以上生活在低收入和中等收入國家。每年有近1000萬新病例。癡呆癥是由影響大腦的各種疾病和損傷引起的。阿爾茨海默病(alzheimer’s?disease，ad)是癡呆癥最常見的形式，可能占病例數(shù)的60-70％，并且隨著年齡的增長，患病的風險也在增加。

2、阿爾茨海默病為一種神經(jīng)退化的疾病，有將近七成的風險因子與遺傳有關；其他的風險因子還有頭部外傷、憂郁癥和高血壓等。ad的癥狀包括記憶障礙、失語、失用、失認以及視空間能力損害等。此外，患者的抽象思維和計算力也會損害，常伴隨人格和行為的改變。

3、阿爾茨海默病的真正成因至今仍然不明。有很多假說嘗試去解釋ad的發(fā)病機理，如aβ級聯(lián)假說、膽堿能假說、tau蛋白異常磷酸化假說、神經(jīng)炎癥假說和金屬離子紊亂假說等。ad大腦神經(jīng)病理學改變的特征包括，aβ蛋白沉積形成的淀粉樣蛋白斑，神經(jīng)原纖維纏結(過度磷酸化tau蛋白組成的胞內(nèi)聚集體)，突觸的喪失、萎縮、神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)(例如乙酰膽堿)的選擇性耗竭以及路易體(少數(shù)情況)，以上這些情況導致了神經(jīng)元之間的信息交流障礙甚至神經(jīng)元的死亡，最終導致ad。其中β-淀粉樣蛋白(aβ)沉積假說和異常磷酸化tau蛋白假說是最經(jīng)典的病理和假說。

4、目前并沒有可以阻止或逆轉病程的治療，只有少數(shù)方法或許可以暫時緩解或改善癥狀，目前的藥物開發(fā)思路主要是圍繞清除β-淀粉樣蛋白(aβ)，調(diào)節(jié)tau蛋白，以及乙酰膽堿酯酶抑制劑(ache)等這些熱門的領域。

5、最近科學家對tripartite?motif(trim)蛋白家族的研究發(fā)現(xiàn)了幾種trim分子具有阻止tau聚集的強大能力，他們發(fā)現(xiàn)其中trim11的表達水平在阿爾茨海默病大腦中顯著下調(diào)。并且，其表達水平和tau聚集之間存在很強的負相關性，在高表達trim11的大腦中，tau聚集水平較低，反之亦然。進一步的機理研究發(fā)現(xiàn)trim11可以對有缺陷的tau蛋白和過量正常的tau蛋白進行蛋白酶體降解，從而將tau蛋白與泛素蛋白酶體途徑聯(lián)系起來。trim11還可以作為阻止tau錯誤折疊和聚集的分子伴侶，以及發(fā)揮tau蛋白解聚酶的作用，分解已經(jīng)形成的tau蛋白聚集體。trim11可防止細胞內(nèi)tau蛋白的自發(fā)性和誘導性的聚集，使tau蛋白保持可溶性狀態(tài)。因此，trim11是一種重要的神經(jīng)保護因子。

6、apoe基因編碼的蛋白質(zhì)稱為載脂蛋白(apolipoprotein?e)，它在體內(nèi)有多種功能，其中之一是參與脂質(zhì)代謝和膽固醇運輸。apoe有3種常見的等位基因(e2、e3、e4),它們的區(qū)別在于apoe基因水平上兩個位點的改變，反應到蛋白層面就是這兩個位點(第112個氨基酸和第158個氨基酸)究竟是半胱氨酸還是精氨酸，如果一條染色體上編碼得到的apoe兩個位點都是cys，這條染色體就是apoe2型，如果第112號位是cys，而第158號位是arg，那么這個載脂蛋白就是apoe3，兩個都是arg，那就是apoe4。3種等位基因可以組合成為6種基因型，apoe2/2，2/3，2/4，3/3，3/4和4/4，從而編碼三種apoe蛋白異構體，分別為apoe2、apoe3和apoe4。ad與該基因的多態(tài)性密切相關。apoe3純合人群的ad發(fā)病率設為基準，含有apoe4人群的ad發(fā)病率均高于apoe3純合人群的，兩種雜合含e4/e2和e4/e3患病概率分別是apoe3純合的2.6和3.6倍；而純的e4/e4的ad發(fā)病率則猛增到15.5倍。e2則能降低ad的發(fā)病概率。

7、基因治療是應用現(xiàn)代分子生物學技術和精準醫(yī)學理論和實踐的新興治療方法，是極具發(fā)展?jié)摿Φ纳镝t(yī)藥領域之一，未來發(fā)展前景可觀?；赼av的基因療法作為一種非常具有前景的替代方案受到大家積極地推崇，最近的臨床實驗也成功地凸顯了其實用性。lx1001是lexeo?therapeutics公司開發(fā)的一種基于aav的在研基因療法，旨在將表達保護性apoe2的轉基因遞送到攜帶兩個apoe4等位基因的阿爾茨海默病患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)，以阻止或減緩疾病進展。2022年2月，公布了lx1001在治療apoe4純合子ad患者的1/2期臨床試驗中獲得積極數(shù)據(jù)。從臨床數(shù)據(jù)中顯示，在一次治療后并隨訪超過12個月的兩名患者中，腦脊液中的tau蛋白水平和磷酸化tau蛋白水平與基線相比顯著降低，未觀察到嚴重安全性和耐受性問題。最近科學家用aav將trim11遞送到多種tau蛋白病小鼠模型的大腦中。發(fā)現(xiàn)trim11顱內(nèi)遞送可有效防止tau蛋白的病理形成和神經(jīng)炎癥。除此之外，trim11還可以有效防止認知和運動功能下降。

技術實現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明提供了一種共表達trim11和apoe2的重組腺相關病毒載體，實現(xiàn)了trim11蛋白和apoe2蛋白的共表達，同時下調(diào)tau蛋白和β樣蛋白?？梢杂糜谥委煱柶澓ＤY藥物的研發(fā)過程。

2、本發(fā)明采用的技術方案如下：

3、一種核酸序列構建體，其特征在于，包括復合序列，所述復合序列由編碼三螺旋結構蛋白11(trim11)和人載脂蛋白e2(apoe2)的核苷酸序列，連接編碼兩個蛋白的核苷酸序列之間的自加工單元序列(apu)組成。

4、優(yōu)選地，所述三螺旋結構蛋白11的氨基酸序列入seq?id?no.1所示；所述人載脂蛋白e2的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；所述的自加工單元序列，包含但不限于內(nèi)部核糖體進入位點序列(ires)，編碼2a肽或類2a肽的序列，intein、b型細菌體intein樣結構域(bil)、furin序列及其衍生物。

5、優(yōu)選地，所述復合序列中的自加工單元序列2a肽或類2a肽，包含但不限于源于手足口病毒的f2a、源于馬甲型鼻炎病毒的e2a、源于豬捷申病毒的p2a和源于明脈扁刺蛾病毒的t2a。

6、優(yōu)選地，所述復合序列中的自加工單元序列為源于豬捷申病毒的p2a。

7、優(yōu)選地，所述復合序列的核苷酸序列具有如seq?id?no.7～11任一項所示核苷酸序列的核酸。

8、本發(fā)明中所述的復合序列，還可以是具有如seq?id?no.7～11所述序列中任意的片段中取代、缺失或添加一個或多個核苷酸的核酸；或者與所述核酸的序列至少具有85％的同源性，且編碼trim11(seq?id?no.1)和apoe2(seq?id?no.3)蛋白的核酸；或者與上述任一項部分互補或完全互補的核酸。

9、本發(fā)明還提供了一種真核表達載體，包含所述的seq?id?no.7～11任一項所示核苷酸序列的核酸。

10、優(yōu)選地，所述載體為病毒，非病毒，裸dna中的一種。

11、優(yōu)選地，所述非病毒載體選自納米載體、高分子載體中的一種，如陽離子多聚物載體、脂質(zhì)體載體和納米顆粒載體等，通過包裹所述的核苷酸序列構建體，將其遞送到目標細胞和組織中表達；所述病毒載體選自慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體中至少一種。

12、優(yōu)選地，所述腺相關病毒載體的血清型包含但不限于aav1、aav2、aav4、aav5、aav8、aav9、php.eb和aav-retro。

13、本發(fā)明還提供了一種所述的核酸序列構建體，或者所述的真核表達載體在制備治療癡呆癥藥物中的應用。

14、本發(fā)明中的核苷酸序列構建體可以通過體內(nèi)途徑和體外途徑給藥，實現(xiàn)目的基因在目標細胞和組織中的表達，將目的基因在體外導入人體自身或異體細胞(或異種細胞)，經(jīng)體外細胞擴增后，再回輸?shù)襟w內(nèi)?；蛘邔⑺龅暮塑账嵝蛄醒b配到特定的真核表達載體，直接導入體內(nèi)，這種載體可以是病毒或非病毒，甚至是裸dna。所述的病毒、非病毒載體或裸dna的給藥途徑包含但不限于靜脈注射全身給藥、顱內(nèi)或鞘內(nèi)注射給藥。

15、本發(fā)明提供的核苷酸序列構建體，將編碼trim11蛋白的序列和編碼載脂蛋白apoe的序列通過自加工單元(以p2a為例)連接，構建重組腺相關病毒載體paav-3×flag-trim11-p2a-apoe2-ha(wt)，主要的構建思路為：通過p2a連接trim11基因和apoe2基因，其中trim11通過促進tau蛋白的sumo化和蛋白酶體降解，防止tau蛋白的錯誤折疊和聚集，同時還能作為解聚酶溶解已存在的tau聚集物。載脂蛋白apoe2是一種帶有信號肽的分泌蛋白，可以與aβ結合，并以脂質(zhì)狀態(tài)和apoe亞型依賴的方式促進aβ清除。構建的重組腺相關病毒載體paav-3×flag-trim11-p2a-apoe2-ha(wt)中目的基因的序列示意圖如圖1所示。其中，所述trim11的氨基酸序列信息如下seq?id?no.1所示，編碼所述trim11的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述apoe2的氨基酸序列信息如下seq?id?no.3所示；編碼所述apoe2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；p2a的氨基酸序列信息如下seq?id?no.5所示，編碼所述p2a的核苷酸序列信息如seq?id?no.6所示。

16、本發(fā)明中的seq?id?no.7～11的序列是通過選取5個不同的在線密碼子優(yōu)化平臺：gensmart、idt、geneart，vectorbuilder和tsingke，對我們的trim11-p2a-apoe2基因進行優(yōu)化，然后轉染293細胞，發(fā)現(xiàn)通過idt、geneart和vectorbuilder(vb)優(yōu)化的序列，表達量明顯提高，其中vertorbuilder優(yōu)化的效果最好，優(yōu)化后的trim11的表達量是野生型的1.91倍，apoe2是野生型的2.57倍。

17、研究發(fā)現(xiàn)，aβ通過激活jnk激酶，促進tau蛋白的過度磷酸化和蛋白積累，另一方面，tau蛋白也能抑制aβ蛋白的降解，因此aβ和tau毒性可以互作形成一個滾雪球的環(huán)路進而不斷加重ad的進程，該機制提示我們，之前針對aβ或tau進行單靶點的藥物開發(fā)可能并不能有效的抑制ad的進程，而將aβ和tau做為合并靶點可能是減慢ad的最有效的方法。因此，本發(fā)明開創(chuàng)性的構建了trim11和apoe2的aav表達載體，并且對密碼子進行優(yōu)化，獲得了細胞中高效共表達trim11和apoe2的基因片段，由此構建了高效共表達trim11和apoe2的重組腺相關病毒載體以及治療阿爾茲海默癥的藥物。實驗表明，攜帶trim11和apoe2的aav病毒能夠直接感染sh-sy5y神經(jīng)母細胞，在靶細胞中過表達攜帶目的基因的aav載體能夠同時下調(diào)tau蛋白和β-淀粉樣蛋白。

18、本發(fā)明將目的基因trim11和apoe2通過自加工單元(auto-processing?unit，apu)連接，構建了核苷酸序列構建體，通過western?blot和elisa驗證了目的基因trim11和apoe2的表達，通過共轉染tau，發(fā)現(xiàn)tau的表達跟載體呈現(xiàn)負相關，tau的表達量隨著trim11的表達下調(diào)，并且呈現(xiàn)劑量依賴效應。然后通過不同的密碼子優(yōu)化平臺對目的基因的密碼子進行優(yōu)化，通過western?blot篩選獲得高效表達的基因片段。用優(yōu)化后的序列構建aav載體，包裝純化aav重組病毒，感染神經(jīng)母細胞sh-sy5y后，驗證了目的基因在宿主細胞中的表達。同時，序列優(yōu)化后的載體與tau共轉染之后，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的載體可以高效的抑制tau的形成。

19、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：本發(fā)明提供的核苷酸序列構建體，可以實現(xiàn)trim11和apoe2的高效共表達，為治療阿爾茲海默病藥物的研究提供了重要基礎。