本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種重組人xvii型膠原蛋白及其制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白(collagen)是發(fā)現(xiàn)最早，含量最豐富的一類細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分。廣泛存在于皮膚、骨骼、肌腱、牙齒、內(nèi)臟(如胃、腸、心肺、血管與食道)、韌帶、鞏膜、眼睛等組織器官，占人體含量的30％-40％之間。膠原蛋白的生物學(xué)功能很大程度由其空間結(jié)構(gòu)決定。不同類型的膠原蛋白生理功能不同，結(jié)構(gòu)也不同。只有具有三級(jí)以上的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)才具有生理功能，而膠原蛋白具有完整的四維空間結(jié)構(gòu)。膠原蛋白是由3條α多肽鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)，每條α鏈都是由g-x-y(x、y代表gly之外的任何氨基酸殘基，x往往是pro，y往往是hyp)重復(fù)單元組成的左手螺旋肽段。其中最常見的序列是“甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸”序列，約占整個(gè)“g-x-y”序列的12％，“甘氨酸-脯氨酸-y”或“甘氨酸-x-羥脯氨酸”序列約占44％，其他“甘氨酸-x-y”序列構(gòu)成剩余的44％。而這些重復(fù)三肽“甘氨酸-x-y”的數(shù)量接近全部序列的1/3，對(duì)維持膠原的結(jié)構(gòu)起重大作用。3條α鏈在氨基酸殘基的相互作用下，以同一軸為中心，以右手超螺旋方式形成穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白對(duì)于器官支撐、機(jī)體功能保護(hù)起著重要的作用，它也是結(jié)締組織韌性的主要因素。結(jié)締組織將全身的細(xì)胞粘合，連接成組織和器官，因此，膠原蛋白對(duì)人體有重要的作用。

2、膠原蛋白目前已發(fā)現(xiàn)28種不同的類型，不同種族、不同組織中的膠原有著不同的化學(xué)組成或不同的構(gòu)型。根據(jù)膠原蛋白的功能，可以分為成纖維膠原和非成纖維膠原，從人體來(lái)說(shuō)，最常見膠原主要由四種形態(tài)：i型膠原蛋白在人體內(nèi)數(shù)量最大，主要存在于成人皮膚和骨組織中，ii型膠原主要存在于軟骨組織，iii型膠原蛋白組要存在于嬰幼兒的皮膚，血管，內(nèi)膜，腸，胃器官中。iv型膠原蛋白主要存在于各組織器官的基底膜，胎盤和品狀體中。

3、xvii型膠原蛋白(collagen?xvii,17型膠原蛋白，col17)，是一種跨膜蛋白，最初是由diaz等人于1980年代在大皰性類天皰瘡(bullous?pemphigoid,bp)中發(fā)現(xiàn)，是一種ii型跨膜蛋白，其最明顯的結(jié)構(gòu)特征是n端位于細(xì)胞內(nèi)，由501個(gè)氨基酸組成，其中包含有4個(gè)由24-26個(gè)氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列，c端為較長(zhǎng)的細(xì)胞外肽鍵，與皮膚基底膜透明板的錨纖維連接。xvii型膠原蛋白的胞外區(qū)膠原結(jié)構(gòu)域含有重復(fù)的“甘氨酸-x-y(glycine-x-y)”三元組，其中x通常是脯氨酸，y是羥脯氨酸。穿插的非膠原結(jié)構(gòu)域從羧基末端(c末端)起分別稱為nc1、nc2直至nc16。xvii型膠原蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)是三聚體，由膠原結(jié)構(gòu)域的三螺旋組裝驅(qū)動(dòng)。免疫電子顯微鏡研究顯示，在基底膜中，xvii型膠原蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)穿過(guò)基底膜的透明層(laminalucida)進(jìn)入致密層(laminadensa)，然后彎曲回透明層。旋轉(zhuǎn)陰影電子顯微鏡成像也證明，其胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)具有桿狀形態(tài)，而呈堿性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域部分(icd)則呈球狀。

4、xvii型膠原蛋白是半橋粒的結(jié)構(gòu)成分，在皮膚上皮細(xì)胞和其他分層上皮細(xì)胞，如口腔粘膜(oralmucosa)、角膜(cornea)、宮頸(cervix)和陰道(vagina)中表達(dá)較為豐富。胎盤(placenta)的鱗狀上皮細(xì)胞(squamousepithelia?cell)、合胞細(xì)胞和細(xì)胞增殖細(xì)胞中(syncytialandcytotrophoplastic?cell)也有大量的xvii型膠原蛋白?？谇恢械膞vii型膠原蛋白在牙釉質(zhì)形成中是必需的。xvii型膠原蛋白在乳腺和腸道上皮有較低水平的表達(dá)。在層狀上皮(layeredepithelia)中，xvii型膠原蛋白主要在基底細(xì)胞(basal?cells)中表達(dá)。在皮膚中，它既存在于毛囊中又存在于間質(zhì)表皮中。除了半橋粒型表達(dá)外，非半橋粒型xvii型膠原蛋白還存在于基底角質(zhì)細(xì)胞的可溶性膜的頂側(cè)表面上。半橋粒是基底細(xì)胞與下方基底膜帶之間的主要連接結(jié)構(gòu)，由角質(zhì)形成細(xì)胞真皮側(cè)胞膜的不規(guī)則突起與基底膜帶相互嵌合而成。半橋粒有使細(xì)胞固著于基膜的作用，從而加強(qiáng)細(xì)胞間的連接。半橋粒隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，并導(dǎo)致基底細(xì)胞出現(xiàn)微分離。在所有半橋粒成分中，xvii型膠原蛋白是唯一一種在衰老過(guò)程中顯著減少的成分。目前的研究也表明，半橋粒的不穩(wěn)定性是由內(nèi)在老化和紫外線誘導(dǎo)的光老化引起的基因組不穩(wěn)定導(dǎo)致的xvii型膠原蛋白水解引起的。利用uvb照射會(huì)導(dǎo)致皮膚光老化，在小鼠和人類表皮中均會(huì)出現(xiàn)色素沉著和半橋粒損傷。xvii型膠原蛋白缺失的小鼠皮膚色素沉著更明顯，傷口愈合緩慢；而xvii型膠原蛋白過(guò)度表達(dá)能顯著減少色素沉著，而且能促進(jìn)傷口愈合。

5、xvii型膠原蛋白在維持表皮細(xì)胞黏附的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)元素之間的聯(lián)系方面發(fā)揮著重要作用。xvii型膠原蛋白胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)直接與整合素α6、層粘連蛋白332和膠原蛋白iv結(jié)合，這些相互作用介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞與基底層基質(zhì)的黏附，并與胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)脫落一起調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移。此外，還有研究顯示xvii型膠原蛋白與周斑蛋白(periplakin)、dfnb31、cstf2t、pplil1、plod3、cdh1、pnkp、hras、spdl1、egfr和ubiquilin2可能結(jié)合或具有相互作用，這些相互作用組可能參與xvii型膠原蛋白的生物合成、運(yùn)輸和翻譯后修飾或其非半橋粒型的功能。

6、研究顯示，皮膚的老化與成體干細(xì)胞的自我更新和功能分化密切相關(guān)。皮膚中的干細(xì)胞(如表皮干細(xì)胞，毛囊干細(xì)胞，黑色素細(xì)胞干細(xì)胞)生態(tài)位的維持對(duì)干細(xì)胞功能的發(fā)揮至關(guān)重要。細(xì)胞與細(xì)胞、和細(xì)胞與胞外基質(zhì)間(ecm)的黏附對(duì)于建立和維持干細(xì)胞生態(tài)位結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，與下層細(xì)胞外基質(zhì)的黏附被認(rèn)為是維持表皮干細(xì)胞(esc)的重要因素，xvii型膠原蛋白在干細(xì)胞生態(tài)位的維持中發(fā)揮著重要的作用。因此，xvii型膠原蛋白對(duì)皮膚的再生，抗老化具有重要作用。

7、脫發(fā)是皮膚老化的常見表現(xiàn)之一，毛囊干細(xì)胞(hfsc)負(fù)責(zé)毛囊毛發(fā)的周期性再生，毛囊干細(xì)胞接收來(lái)自周圍環(huán)境的信號(hào)，并主動(dòng)發(fā)出信號(hào)以調(diào)節(jié)自身生態(tài)位的組織和功能。隨著毛囊干細(xì)胞的老化，dna損傷反應(yīng)延長(zhǎng)(ddr，dna?damage?response)，可激活elane(中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶：一種存在于中性粒細(xì)胞中的酶，參與免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程，能夠降解多種蛋白質(zhì))，導(dǎo)致維持hfscs的關(guān)鍵分子膠原蛋白col17的水解流失，從而觸發(fā)hfsc的衰老，老化的毛囊干細(xì)胞(hfsc)通過(guò)表皮終末分化為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，周期性地從皮膚中清除。隨著這種非典型分裂的重復(fù)，毛囊干細(xì)胞(hfsc)從基底膜分離，毛囊干細(xì)胞生態(tài)位逐漸縮小，毛囊本身變小(小型化)，最終導(dǎo)致頭發(fā)稀疏和脫落。研究顯示，強(qiáng)制性維持膠原蛋白col17的表達(dá)可以抑制毛囊干細(xì)胞衰老，從而可以延緩過(guò)度的脫發(fā)。

8、目前，膠原蛋白在化妝品，護(hù)膚，抗衰和組織修復(fù)中應(yīng)用廣泛。而當(dāng)前市面上銷售的膠原蛋白產(chǎn)品主要從動(dòng)物組織如豬，牛，魚等中提取，而外源性提取的膠原蛋白難于避免難于避免病毒感染以及致敏性的風(fēng)險(xiǎn)。且常規(guī)方法提取的的膠原蛋白具有較強(qiáng)的凝血功能，導(dǎo)致其在組織產(chǎn)品應(yīng)用時(shí)帶來(lái)了極大的風(fēng)險(xiǎn)。而且xvii型膠原蛋白作為跨膜蛋白，難于進(jìn)行分泌表達(dá)，表達(dá)量低下和規(guī)?；a(chǎn)困難也為xvii膠原蛋白的開發(fā)和應(yīng)用提供了巨大的挑戰(zhàn)。因此采用基因工程技術(shù)提取表達(dá)重組膠原蛋白，具有可持續(xù)性，可以極大程度上簡(jiǎn)化提取流程，降低提取難度。

9、雖然xvii型膠原蛋白在抗衰和防脫發(fā)領(lǐng)域的功效已被證實(shí)，但是其主要的核心功能片段卻知之甚少，本發(fā)明通過(guò)利用計(jì)算機(jī)模擬及人工智能的方式找到xvii型膠原蛋白的最小活性功能片段，然后利用重組表達(dá)系統(tǒng)對(duì)活性片段進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的生物學(xué)活性。其生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，快捷，且易于大規(guī)模制備。可廣泛應(yīng)用于皮膚抗衰，防脫發(fā)，白發(fā)等領(lǐng)域的治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明設(shè)計(jì)的目的在于提供一種重組人xvii型膠原蛋白及其制備方法、應(yīng)用，具體通過(guò)以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)：

2、本發(fā)明第一方面提供了一種重組人xvii型膠原蛋白，所述重組人xvii型膠原蛋白為：col17a3a、col17a3b、col17a3c、col17a3d或col17a3e中的任一種。

3、進(jìn)一步，所述col17a3a的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，或在seq?id?no.2基礎(chǔ)上進(jìn)行一定程度上的氨基酸替換、插入、取代、添加、缺失等修改后的氨基酸序列，或與seqid?no.2氨基酸序列具有大于80％同源性的氨基酸序列；

4、所述col17a3b的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，或在seq?id?no.3基礎(chǔ)上進(jìn)行一定程度上的氨基酸替換、插入、取代、添加、缺失等修改后的氨基酸序列，或與seq?id?no.3氨基酸序列具有大于80％同源性的氨基酸序列；

5、所述col17a3c的氨基酸序列如seq?id?no.4所示，或在seq?id?no.4基礎(chǔ)上進(jìn)行一定程度上的氨基酸替換、插入、取代、添加、缺失等修改后的氨基酸序列，或與seq?id?no.4氨基酸序列具有大于80％同源性的氨基酸序列；

6、所述col17a3d的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，或在seq?id?no.5基礎(chǔ)上進(jìn)行一定程度上的氨基酸替換、插入、取代、添加、缺失等修改后的氨基酸序列，或與seq?id?no.5氨基酸序列具有大于80％同源性的氨基酸序列；

7、所述col17a3e的氨基酸序列如seq?id?no.6所示，或在seq?id?no.6基礎(chǔ)上進(jìn)行一定程度上的氨基酸替換、插入、取代、添加、缺失等修改后的氨基酸序列，或與seq?id?no.6氨基酸序列具有大于80％同源性的氨基酸序列。

8、進(jìn)一步，所述膠原蛋白的n端添加有蛋白質(zhì)標(biāo)簽，優(yōu)選n端有trx-his-thrombin-stag標(biāo)簽。

9、本發(fā)明第二方面提供了一種重組人xvii型膠原蛋白的制備方法，該方法包括以下步驟：

10、1)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)ncbi中檢索找到xvii膠原蛋白的氨基酸序列，序列編號(hào)為：q9umd9.3，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示，利用ncib?blast工具對(duì)其尋找序列中的保守區(qū)域，利用modeller,swiss-model工具，預(yù)測(cè)膠原蛋白的三維結(jié)構(gòu)，利用分子動(dòng)力學(xué)方式模擬對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化和能量最小化研究，并通過(guò)分子對(duì)接工具預(yù)測(cè)潛在的活性功能區(qū)：seqid?no.2～6所示的氨基酸序列；

11、2)將seq?id?no.2～6所示的氨基酸序列克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pet32a中；通過(guò)bglii和ecori酶切位點(diǎn)將5條目的片段構(gòu)建至pet32a質(zhì)粒中，并在目的片段n端連接了trx,his,thrombin以及s?tag標(biāo)簽，同時(shí)加入腸激酶酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pet32a-a3a，pet32a-a3b，pet32a-a3c，pet32a-a3d，pet32a-a3e表達(dá)質(zhì)粒；將表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞bl21(de3)并培養(yǎng)，制得菌體；

12、3)用超聲破碎緩沖液重懸步驟2)制得的菌體，然后進(jìn)行超聲破碎裂解菌體，破碎后用冷凍離心機(jī)離心去除沉淀，取上清液至新的離心管中再次離心，保留上清液；連接akta管路，設(shè)置流速為8ml/min，用0.5m?naoh沖洗；然后再用ddh2o沖洗；安裝純化柱沖洗后將離心后的上清液上樣，流速4ml/min；用8mm濃度的咪唑洗雜，之后用不同濃度的咪唑線性梯度洗脫，收集洗脫液，過(guò)夜透析至pbs中；如果需要切除標(biāo)簽的目的蛋白，加入具有his標(biāo)簽的腸激酶，于4℃孵育16h后，收集流穿液，即為去除標(biāo)簽的目的膠原蛋白col17a3a，col17a3b，col17a3c，col17a3d，col17a3e。

13、進(jìn)一步，步驟2)中培養(yǎng)的具體步驟為：取bl21感受態(tài)細(xì)胞，冰上溶解后，加入表達(dá)質(zhì)粒，混勻后冰上靜置，然后水浴熱激，加入無(wú)抗性2yt培養(yǎng)基后，37℃，200rpm搖床培養(yǎng)復(fù)蘇60min；取菌液涂布到含amp抗性放入lb固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜；之后挑取單克隆菌落接種至1000ml的培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)至od600達(dá)到0.8，加入1mm?iptg誘導(dǎo)表達(dá)18h后冷凍離心機(jī)離心，收集菌體。

14、進(jìn)一步，步驟3)中純化柱沖洗的具體方法為：設(shè)置流速為8ml/min，用ddh2o沖洗60ml，然后用0.1m?naoh沖洗80ml；再用ddh2o沖洗80ml；最后上樣前用0.01m?pbs沖洗50ml。

15、本發(fā)明第三方面提供了一種制品，所述制品上述的膠原蛋白或上述的制備方法制得的膠原蛋白或組合物，所述制品包括藥物、藥物組合物、醫(yī)療器材、生物材料、組織工程產(chǎn)品、化妝品或保健品。

16、本發(fā)明第四方面提供了上述的膠原蛋白或上述制備方法制得的膠原蛋白在制備治療皮膚抗衰老的藥品、藥品組合物、醫(yī)療器材、生物材料、組織工程產(chǎn)品、化妝品或保健品中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明第五方面提供了上述的膠原蛋白或上述制備方法制得的膠原蛋白在制備治療防脫發(fā)及白發(fā)的藥品、藥品組合物、醫(yī)療器材、生物材料、組織工程產(chǎn)品、化妝品或保健品中的應(yīng)用。

18、xvii型膠原蛋白分子量極大(180kd)，含有1497個(gè)氨基酸，而對(duì)于其活性功能區(qū)，目前卻知之甚少，且xvii型膠原蛋白為跨膜蛋白，利用傳統(tǒng)的膠原蛋白提取方式，生產(chǎn)困難，成本極大，且其跨膜結(jié)構(gòu)域的存在使其無(wú)法有效分泌到胞外，難于進(jìn)行量產(chǎn)。

19、本發(fā)明采用計(jì)算機(jī)模擬及分子對(duì)接方式研究xvii型膠原蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)，利用人工智能方式預(yù)測(cè)xvii型膠原蛋白的功能片段，將膠原蛋白的氨基酸序列從1497個(gè)縮小至200aa以內(nèi)的胞外功能區(qū)。降低了其分子量，不僅使其實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，同時(shí)利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)表達(dá)產(chǎn)量高，生產(chǎn)周期短，且成本低，易進(jìn)行大規(guī)模的制備。另外，與傳統(tǒng)的膠原蛋白及大分子重組膠原蛋白相比。

20、本發(fā)明利用大腸桿菌重組表達(dá)的系統(tǒng)對(duì)選定的xvii膠原蛋白進(jìn)行重組表達(dá)，將目標(biāo)序列a3a，a3b，a3c，a3d，a3e構(gòu)建至原核表達(dá)載體pet32a中，為了方便產(chǎn)品純化，a3a，a3b，a3c，a3d，a3e序列n端融合了trx,his,thrombin,s?tag等標(biāo)簽序列。通過(guò)原核(bl21)發(fā)酵，將目標(biāo)序列表達(dá)出來(lái)，然后取上清進(jìn)行鎳柱親和純化。獲得帶標(biāo)簽的候選序列，如需進(jìn)一步去除標(biāo)簽，可通過(guò)腸激酶進(jìn)行切除，獲得目的膠原蛋白序列。

21、本發(fā)明通過(guò)軟件分析，鎖定膠原蛋白的功能區(qū)至200aa以內(nèi)，并對(duì)其功能片段進(jìn)行原核表達(dá)，提純，獲得目的膠原蛋白片段a3a，a3b，a3c，a3d，a3e。本發(fā)明通過(guò)在角質(zhì)形成細(xì)胞hacat中進(jìn)行黏附活性鑒定，證明了這四個(gè)片段具有良好的生物學(xué)活性。

22、xvii型膠原蛋白氨基酸序列：(seq?id?no.1)

23、mdvtkknkrdgtevterivtetvttrltslppkggtsngyaktas

24、lgggsrlekqslthgssgyinstgstrghastssyrrahspastlp

25、nspgstferkthvtrhayegsssgnsspeyprkefassstrgrsqt

26、reseirvrlqsaspstrwtelddvkrllkgsrsasvsptrnssntl

27、pipkkgtvetkivtassqsvsgtydatildanlpshvwsstlpags

28、smgtyhnnmttqsssllntnaysagsvfgvpnnmascsptlhpg

29、lstsssvfgmqnnlapslttlshgttttstaygvkknmpqspaav

30、ntgvstsaacttsvqsddllhkdckflilekdntpakkemellim

31、tkdsgkvftaspasiaatsfsedtlkkekqaaynadsglkaeang

32、dlktvstkgktttadihsygssggggsgggggvggagggpwgp

33、apawcpcgsccswwkwllgllltwllllgllfglialaeevrkl

34、karvdelerirrsilpygdsmdriekdrlqgmapaagadldkigl

35、hsdsqeelwmfvrkklmmeqengnlrgspgpkgdmgspgpkgd

36、rgfpgtpgipgplghpgpqgpkgqkgsvgdpgmegpmgqrgreg

37、pmgprgeagppgsgekgergaagepgphgppgvpgsvgpkgssgs

38、pgpqgppgpvglqglrgevglpgvkgdkgpmgppgpkgdqgek

39、gprgltgepgmrglpgavgepgakgamgpagpdghqgprgeqg

40、ltgmpgirgppgpsgdpgkpgltgpqgpqglpgtpgrpgikgepga

41、pgkivtsegssmltvpgppgppgamgppgppgapgpagpaglpgh

42、qevlnlqgppgppgprgppgpsipgppgprgppgeglpgppgppgsf

43、lsnsetflsgppgppgppgpkgdqgppgprghqgeqglpgfstsgs

44、ssfglnlqgppgppgpqgpkgdkgdpgvpgalgipsgpseggssst

45、myvsgppgppgppgppgsisssgqeiqqyiseymqsdsirsylsgvq

46、gppgppgppgpvttitgetfdyselashvvsylrtsgygvslfsssi

47、ssedilavlqrddvrqylrqylmgprgppgppgasgdgsllsldy

48、aelssrilsymsssgisiglpgppgppglpgtsyeellsllrgsefrgi

49、vgppgppgppgipgnvwssisvedlssylhtaglsfipgppgppgpp

50、gprgppgvsgalatyaaensdsfrselisyltspdvrsfivgppgpp

51、gpqgppgdsrllstdashsrgssssshsssvrrgssysssmstggg

52、gagslgaggafgeaagdrgpygtdigpgggygaaaeggmyag

53、nggllgadfagdldynelavrvsesmqrqgllqgmaytvqgpp

54、gqpgpqgppgiskvfsaysnvtadlmdffqtygaiqgppgqkgem

55、gtpgpkgdrgpagppghpgppgprghkgekgdkgdqvyagrrrrrsiavkp.

56、a3a序列：(seq?id?no.2)

57、kgdrgfpgtpgipgplghpgpqgpkgqkgsvgdpgmegpmgqrg

58、regpmgprgeagspgpkgdmgspgpkgdrgfpgtpgipgplghpg

59、pqgpkgqkgsvgdpgmegpmgqrgregpmgprgeagspgpkgd

60、mgspgpkgdrgfpgtpgipgplghpgpqgpkgqkgsvgdpgmegpmgqrgregpmgprgea。

61、a3b序列：(seq?id?no.3)

62、gspgpkgdmgspgpkgdrgfpgtpgipgplghpgpqgpkgqkgsv

63、gdpgmegpmgqrgregpmgprgeagspgpkgdmgspgpkgdrg

64、fpgtpgipgplghpgpqgpkgqkgsvgdpgmegpmgqrgregpm

65、gprgeagspgpkgdmgspgpkgdrgfpgtpgipgplghpgpqgpkgqkgsvg。

66、a3c序列：(seq?id?no.4)

67、kgdrgfpgtpgipgplghpgpqgpkgqkgsvgdpgmegpmgqrg

68、regpmgprgeagspgpkgdmgspgpkgdrgfpgtpgipgplghpg

69、pqgpkgqkgsvgdpgmegpmgqrgregpmgprgeagspgpkgdmgspgpkgdrgfpgtpgipgplghpgpqgpkgqkgsvg。

70、a3d序列：(seq?id?no.5)

71、drgfpgtpgipgplghpgpqgpkgqkgsvg。

72、a3e序列：(seq?id?no.6)

73、gipgplghpgpqgpkgqkgsvgdpgmegpm。